Integration of amino acid, acylcarnitine and steroids analysis in single FIA/LC-MS/MS platform

Význam tématu

Analýza sušených kapek krve (DBS) pomocí LC-MS/MS přináší výhody v minimálním odběru objemu, jednodušším skladování a sníženém riziku kontaminace. Integrovaná detekce aminokyselin, acylkarnitinů a steroidů umožňuje komplexní screening a snižuje počet falešně pozitivních výsledků, což je zásadní pro novorozenecké a klinické diagnostické programy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jednotnou platformu pro simultánní stanovení 8 aminokyselin, 17 acylkarnitinů a 5 klíčových steroidů (kortisol, 21-deoxykortisol, 11-deoxykortisol, androstenedion, 17-hydroxyprogesteron) z jediné sušené kapky krve. Systém kombinuje FIA pro rychlý screening aminokyselin a acylkarnitinů a LC pro selektivní stanovení steroidů v rámci dvou automatizovaných injekcí během 7 minut.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci z DBS (průměr 5 mm) byla použita 80% acetonitril-voda s vnitřními standardy. Platforma zahrnuje:

• UHPLC Nexera s pumpami LC-30AD a autosamplerem SIL-30AC
• High-pressure ventily FCV-12AH pro přepínání mezi FIA a LC režimem
• Guard Column GL Sciences Cartridge (10 mm × 1,5 mm I.D.) pro FIA a Phenomenex Kinetex 2,6 µm XB-C18 (50 mm × 2,1 mm I.D.) pro steroidy
• Triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr LCMS-8050 s heated ESI (interface 400 °C, DL 250 °C, heating gas 500 °C)
• Optimalizované gradientní programy mobilních fází (0,1 % kyselina mravenčí/voda – methanol) a specifické MRM přechody

Hlavní výsledky a diskuse

Systém umožnil analýzu aminokyselin a acylkarnitinů za 74 sekund (1 µL injekce) a steroidů za 5 minut (10 µL injekce), s celkovou dobou 7 minut pro oba fyziologicky významné panely. Koeficient variačního rozpětí (CV) většiny analyzovaných látek byl pod 9 %, limit detekce pro 17-hydroxyprogesteron dosahoval 0,19 ng/mL. Metoda vykazovala lineární odezvu napříč klinicky relevantními koncentracemi a spoolehlivé obnovy v kvalitativních kontrolách CDC.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Minimální spotřebu vzorku (1 µL extraktu)
• Rychlý multiplexní screening klíčových biomarkerů
• Snížení falešně pozitivních a falešně negativních výsledků
• Jednodušší logistiku odběru, skladování a transportu vzorků v programech novorozeneckého screeningu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření panelu analyzovaných látek (nové metabolity, peptidy, vitaminy), integrace s mikrofluidními systémy a vyšší míra automatizace. Navíc využití pokročilých algoritmů strojového učení pro zpracování a interpretaci dat slibuje další zlepšení diagnostické přesnosti a rychlosti vyhodnocení.

Závěr

Popsaná platforma úspěšně spojuje FIA a LC-MS/MS pro komplexní stanovení aminokyselin, acylkarnitinů a steroidů z jednoho DBS vzorku. Metoda je rychlá, citlivá a reproducibilní, vhodná pro rutinní screeningové i výzkumné aplikace s minimálním objemem vzorku.

Reference

• Cambridge Isotope Laboratories, Inc. – stabilní izotopové standardy
• Newborn Screening Quality Assurance Program, Centers for Disease Control and Prevention (CDC)