Shimadzu Solutions for Application Notebook - Clinical Research - Application Notebook

Význam tématu

Ve zdravotnické a klinické výzkumné praxi je stále naléhavější potřeba rychlých, přesných a vysoce selektivních analýz biologických vzorků. Kapalinová chromatografie tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) v kombinaci s plně automatizovanou předúpravou vzorků umožňuje zjednodušenou manipulaci s velkým počtem vzorků, minimalizaci lidské chyby a zkrácení doby analýzy. Tento sborník shrnuje řadu aplikací LC-MS/MS a příbuzných technik pro terapeutické monitorování léčiv, analýzu klinických a toxikologických vzorků, metabolomiku a dopingové testování.

Cíle a přehled jednotlivých studií

• Optimalizace vysokopropustného terapeutického monitorování (TDM) farmakokinetických léků (antiepileptika, antiarytmika) pomocí plně automatizovaného systému CLAM-2000 + LCMS-8040.
• Validace a porovnání automatizovaného předzpracování s manuální metodou pro analýzu protisrážlivých a imunosupresivních látek v krvi.
• Simultánní stanovení psychotropních látek v séru, plazmě a moči s nízkou detekční mezí a vysokou přesností.
• Kvantitativní metodika pro β-laktamová antibiotika v lidské plazmě s rychlým proteinovým křesáním a nízkým objemem injekce.
• Automatizované stanovení hydrogilných metabolitů a volných aminokyselin v krvi a moči s CLAM-2000 pohledem na biomarkery.
• Analýza enzymatické aktivity v suchých krevních skvrnách (DBS) prostřednictvím on-line SPE-LC-MS/MS.
• Integrované měření aminokyselin, acylkarnitinů a steroidů v jediném FIA/LC-MS/MS běhu pro novorozenecký screening.
• Rychlá protokolární metoda pro screening a kvantifikaci omamných a toxických látek v moči s CLAM-2000.
• 2D separace vysoce polárních dopingových látek (meldonium, adrenergní činidla) ve vzorcích moči.
• Screening kyanidu v séru za 15 s bez jakékoliv předúpravy pomocí PESI-MS.
• Metoda multi-target screening (MTS) s MS/MS knihovnou pro toxikologii s rychlým potvrzením více než 1000 látek.
• Vysoce senzitivní stanovení CO v krvi použitím GC-BID.

Použitá metodika a instrumentace

Ve všech případech se využívají přístroje Shimadzu: plně automatizovaný modul CLAM-2000 pro předúpravu vzorků on-line, LC systémy Nexera a Nexera X2, hmotnostní spektrometry LCMS-8040, LCMS-8050, LCMS-8060 a Tracera v kombinaci s BID-detektory. Předúpravy zahrnují proteinové křesání, SPE, derivatizace, ultrafiltraci, vortexování a filtrace, vše automatizované v jednom pracovním cyklu. Užívají se chromatografické kolony s ODS, C18, HILIC, biphenylovými stacionárními fázemi, výměnné SPE sloupce (POROS R1) i ion-chromatografické kolony pro CO.

Hlavní výsledky a diskuse

Metody pro TDM a antiarytmika prokázaly lineární rozsah >3 řády, přesnost 90–110 % a opakovatelnost <5 % RSD. Automatizované předúpravy se fondamentálně rovná manuálním metodám, avšak s ~10× vyšší propustností. Analýzy psychotropních látek a omamných látek v moči dosáhly detekčních mezí pod 1 ng/mL. Pro β-laktamy byly dosaženy LOQ v rozmezí 0,7–6 ng/mL při injekci 2 µL. Metabolomické a aminokyselinové analýzy v krvi a moči vykázaly vyrovnané zotavení, lineární kvantifikace a vynikající stabilitu dat. Pro enzymatickou aktivitu v DBS byly validovány protokoly lyze a přímé on-line SPE quantifikace. Integrované FIA/LC-MS/MS metody pro AAs, ACs a steroidy provádějí více než 60 analyzovaných látek za 7 minut. Screening a kvantifikační metody pro toxikologii (MTS) identifikovaly >1000 látek se spolehlivostí >95 % a citlivostí 5–500 µg/L. PESI-MS detekuje kyanid v krvi bez předúpravy za 15 s s mezerou LOQ ~10 ng/mL. GC-BID stanovení CO dosahuje lineárního rozsahu 2–3900 ppm a umožňuje výpočet CO-Hb srozumitelně a rychle.

Přínosy a praktické využití metody

• Plně automatizované procesy zvyšují propustnost a redukují chyby.
• Metody LC-MS/MS poskytují vysokou selektivitu, citlivost a široký lineární rozsah.
• Přímá ionizace a GC-BID rozšiřují pole aplikací i na jedinečné doplňkové testy (kyanid, CO).
• Sjednocené platformy pro TDM, metabolomiku, toxikologii a dopingový screening optimalizují instrumentální park.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace on-line předúpravy se špičkovými detektory pro komplexnější multiplexní analýzy.
• Rozšíření knihoven MS/MS a budování samo-Učících se algoritmů pro neznámé metabolity a kombinační screening.
• Minimalizace vzorku a aplikace mikrofluidních systémů pro point-of-care testování.
• Validace a standardizace metod v souladu s mezinárodními předpisy pro klinickou a dopinkovou praxi.

Závěr

Výsledky jednotlivých studií jednoznačně ukazují, že automatizace předúpravy ve spojení s LC-MS/MS a příbuznými technikami výrazně zvyšuje efektivitu, spolehlivost a rychlost analýzy ve farmacii, klinické chemii, toxikologii i metabolomice. Robustní metody splňují požadavky na vysokou přesnost, selektivitu a citlivost a představují dimenzi pokročilé laboratorní diagnostiky.

Reference

• Shimadzu Application News C123, C153, PO-CON1722E, PO-CON1714E, AD-0135, PO-CON1732E, PO-CON1720E, PO-CON1714E, C123-C158, LAAN-A-LM-E094, LAAN-A-LM-E123, LAAN-A-LM-E069, C123, G286.
• FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, 2001.
• MHLW Guideline on Bioanalytical Method Validation, 2013.
• l A. Barnes et al., Anal. Bioanal. Chem. (2015), 407, 5354–5379.
• S. Chinaka et al., J. Chromatogr. B, 713 (1998) 353–359.