Simultaneous Analysis of Amino Acids and Acylcarnitines in DBS (Dried Blood Spot) with LCMS-8040

Význam tématu

Aminokyseliny a acylkarnitiny jsou klíčové biomarkery pro sledování poruch metabolismu bílkovin a mastných kyselin. Metoda LC-MS/MS umožňuje jejich rychlou a citlivou analýzu z pouhého kapky krve na sušené kapilární kartě (DBS). Tento přístup je nezbytný zejména v novorozeneckém screeningu, kde je požadována vysoká průchodnost vzorků a minimalizace objemu krve.

Cíle a přehled studie

Cílem studie vyvinuté v Meyer Children’s Hospital (Florencie) bylo vytvořit zkrácený a automatizovaný protokol pro simultánní kvantifikaci aminokyselin a acylkarnitinů z DBS. Metoda kombinuje minimální přípravu vzorku s průtokovou injekcí (FIA) a vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií s trojitým kvadrupólem (LCMS-8040).

Použitá metodika

• Příprava vzorku: 3,2 mm disk z DBS v 96-well destičce.
• Extrakce: Methanol s označenými stabilními izotopy a hydrazinem pro derivatizaci.
• Inkubace 25 min při 37 °C, odpaření pod dusíkem při 45 °C, doplnění 0,05 % HCOOH ve směsi H₂O/MeCN (30/70).
• Analýza: FIA s režimem 70 % B (0,1 % HCOOH v acetonitrilu) při průtoku 0,07 mL/min, injekční objem 40 µL, doba běhu 2,2 min.
• Detekce: ESI(+), neutral loss scan 46 Da pro aminokyseliny, precursor ion scan m/z 85 pro acylkarnitiny, MRM pro vybrané analyty.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf Shimadzu LC-20AD s autosamplerem SIL-20AC.
• Triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr Shimadzu LCMS-8040.
• Podmínky MS: napětí sondy +4,5 kV, rozprašovací plyn 3,0 L/min, sušící plyn 20 L/min, teploty DL 300 °C, block heater 500 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Kontrolní vzorky splnily předem stanovená kritéria přesnosti a linearity. U sedmi klinických vzorků detekce vybraných aminokyselin a acylkarnitinů odhalila u některých jedinců abnormality (např. zvýšené C3 u PA, C8 u MCAD, argininsukcinát u ArgSucc). Extrahované iontové chromatogramy potvrdily dostatečný poměr signál/šum a reprodukovatelnost měření.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce průchodná metoda: analyzováno stovky vzorků za den díky době běhu 2,2 min.
• Minimální objem vzorku: ideální pro novorozenecké DBS.
• Robustnost: stabilní izotopy zajišťují korekci matrix efektu a vysokou reprodukovatelnost.
• Široké uplatnění v screeningu a diagnostice poruch metabolismu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie pro detailnější identifikaci metabolitů, automatizace přípravy vzorků robotickými systémy, rozšíření panelu biomarkerů a využití strojového učení pro pokročilou interpretaci dat. Perspektivně multiplexní metabolomika pro komplexní screening.

Závěr

Navržený protokol na LCMS-8040 poskytuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro simultánní kvantifikaci aminokyselin a acylkarnitinů z DBS. Díky jednoduché a minimální přípravě je vhodný pro novorozenecký screening i rutinní laboratoře zaměřené na diagnostiku poruch metabolismu.

Reference