DEVELOPMENT OF A BIOANALYTICAL SPE LC-MS/MS ASSAY FOR OLIGONUCLEOTIDES

Význam tématu

V posledním desetiletí významně vzrostl výzkum oligonukleotidových terapií. Díky zlepšené cílové specificitě těchto molekul je nezbytné mít citlivé, selektivní a reprodukovatelné bioanalytické metody pro jejich kvantifikaci v biologických matricích. Robustní SPE-LC-MS/MS přispívá k přesnějšímu sledování farmakokinetiky, stability a distribuce oligonukleotidů během vývoje a validace nových léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje vývoj jednoduché, robustní a vysoce výkonné metody pro kvantifikaci oligonukleotidů (15–35 mer) a plně thioovaných oligonukleotidu GEM91® v lidské plasmě a sérech. Klíčová byla optimalizace SPE vzorkové přípravy (reversed-phase HLB a mixed-mode WAX μElution) a její spojení s krátkou sub-2 μm RP C18 chromatografií a tandemovou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií s negativní ESI.

Použitá metodika a instrumentace

• Optimalizace SPE protokolů na 96-well μElution deskách Oasis HLB (reversed-phase) a Oasis WAX (mixed-mode) pro maximální zotavení různě dlouhých oligonukleotidů.
• Testování různých wash a eluce: HFIP/TEA wash a TEA/ACN či TEA/MeOH eluce pro HLB; NH4OAc/MeOH wash a MeOH/TEA eluce pro WAX.
• UPLC separace na prototypové sub-2 μm RP C18 kolonce (2,1×50 mm) s gradientem HFIP/hexylamin ve vodě a methanolu během 5 min.
• Detekce pomocí Xevo TQ-XS QqQ MS v režimu MRM s negativní ESI.

Použitá instrumentace

• Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS (FTN) pro kapalinovou chromatografii.
• Waters Xevo TQ-XS tandemový kvadrupól s ESI-.
• Oasis HLB a Oasis WAX μElution 96-well SPE desky.
• Prototypová RP C18 kolona 1,7 μm, 2,1×50 mm.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální zotavení oligonukleotidů HLB SPE: HFIP/TEA wash a ACN/TEA eluce, WAX SPE: NH4OAc/MeOH wash a MeOH/TEA eluce.
• Vysoké zotavení pro OST standardy (15–35 mer) i pro GEM91, s mírně klesajícím výtěžkem s rostoucí délkou oligonukleotidu.
• Stabilita chromatografických parametrů (retention time, peak area) mezi prvním a 96. injekcí.
• LLOQ pro GEM91 po WAX SPE: 25 ng/mL na 400 μL vzorku, linearita do 10 000 ng/mL (r² > 0,993).
• Celková doba analýzy jen 5 min, injekční objem 10–20 μL.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení ztrát oligonukleotidů díky μElution formátu bez nutnosti zahušťování.
• Vysoká citlivost a selektivita vhodná pro farmakokinetické studije a QA/QC laboratoře.
• Rychlá analýza umožňuje vysokou propustnost vzorků v preklinickém a klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky na širší spektrum modifikovaných oligonukleotidů, integrace s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry, vyšší automatizace SPE procesů (384-well format) a využití strojového učení pro optimalizaci extrakce a chromatografie.

Závěr

Vyvinutá SPE-LC-MS/MS metoda nabízí jednoduchou, robustní a vysoce citlivou analýzu oligonukleotidů různých délek, eliminuje obvyklé adsorpční ztráty a poskytuje rychlé a spolehlivé výsledky vhodné pro podporu vývoje oligonukleotidových terapií.

Reference

• Lame M., Brennan K., Donegan M., Paxton T., Edwards I. Development of a bioanalytical SPE LC-MS/MS assay for oligonucleotides. Waters Corporation Poster MKT20013, 2020.