Sensitive LC-MS/MS Bioanalytical Quantitation of Antisense Oligonucleotides

Význam tématu

Oligonukleotidy se stávají klíčovými léčebnými a výzkumnými molekulami v oblasti genové terapie a biologického výzkumu. Pro jejich kvantifikaci v biologických matricích je nezbytná vysoce citlivá a selektivní analytická metoda, která spolehlivě detekuje i nízké koncentrace v komplexním prostředí lidské plazmy.

Cíle a přehled studie

Cílem tohoto application note je demonstrovat schopnosti tandemu kvadrupólového hmotnostního spektrometru Waters Xevo TQ Absolute spojeného se systémem Waters ACQUITY Premier UPLC pro kvantitativní a kvalitativní analýzu antisense oligonukleotidu GEM91 a komerčních oligonukleotidových standardů v lidské plazmě.

Použitá metodika

Vzorky plazmy byly připraveny sériálními ředěními a extrakcí fenol chloroform isoamylalkohol, následovanou chloroformem. Suché extrakty byly rekonstituovány v roztoku EDTA. Chromatografie probíhala na koloně Oligonucleotide C18 s mobilními fázemi obsahujícími hexafluoroisopropanol a diisopropylethylamin ve vodě a v acetonitrilu. Gradientní eluce trvala 5 minut s průtokem 0,5 ml za minutu. Detekce byla provedena v režimu ESI negative s akvizicí MRM přechodů pro klíčové ionty oligonukleotidů.

Použitá instrumentace

• Waters Xevo TQ Absolute Tandem Quadrupole Mass Spectrometer
• Waters ACQUITY Premier UPLC System
• Waters ACQUITY Premier Oligonucleotide C18 Column 1,7 µm 2,1 x 50 mm
• MassLynx v4.2 a TargetLynx pro akvizici a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla dolní kvantifikační hranice 0,1 ng/ml pro GEM91 a linárního rozsahu až do 10000 ng/ml s hodnotami r2 vyššími než 0,99. Průměrná přesnost kalibračních bodů se pohybovala mezi 87 a 112 %, QC vzorky vykázaly přesnost 90–114 % a reprodukčnost (CV) mezi 1,1 a 10,5 %. MaxPeak HPS technologie pro minimalizaci nespecifické adheze zlepšila obnovu oligonukleotidů a snížila limity detekce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí robustní a vysoce citlivé stanovení antisense oligonukleotidů v lidské plazmě, vhodné pro preklinické a klinické studie farmakokinetiky a toxikologie. Rozšířená lineární dynamika a nízké LLOQ umožňují spolehlivé sledování molekul i při velmi nízkých koncentracích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k automatizaci přípravy vzorků, adaptaci na nové chemické modifikace oligonukleotidů a integraci s dalšími detekčními platformami. Rozšíření aplikace na multiplexní analýzy a vysokokapacitní screening podpoří rychlé nasazení ve výzkumu genové terapie a personalizované medicíně.

Závěr

Použití tandemového kvadrupólu Xevo TQ Absolute v kombinaci se systémem ACQUITY Premier a HPS technologií umožnilo citlivé, přesné a reprodukovatelné kvantifikování antisense oligonukleotidů v lidské plazmě. Metoda je vhodná pro náročné bioanalytické studie v preklinické i klinické fázi.

Reference

1. Guilherme J Guimaraes et al Impact of Nonspecific Adsorption to Metal Surfaces in Ion Pair RP LC MS Impurity Analysis of Oligonucleotides Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 208 114439 2022
2. Jennifer M Nguyen et al Assessing the Impact of Nonspecific Binding on Oligonucleotide Bioanalysis Future Science Bioanalysis 13 16
3. Kathryn Brennan et al Utilization of the ACQUITY Premier System and Column for Improved Oligonucleotide Bioanalytical Chromatographic Performance Waters Application Note 720007119 2021