Improving LC-MS/MS Bioanalytical Quantitation of Oligonucleotides using New High Performance Tandem Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Účinné kvantitativní analýzy oligonukleotidů v biologických matricích jsou klíčové pro vývoj a monitorování antisense terapií a dalších oligonukleotidových léčiv. Analýza těchto sloučenin je komplikovaná díky jejich nízkým koncentracím, negativní ionizaci a nespecifickému vazebnému chování.

Cíle a přehled studie / článku

• Ověřit reprodukovatelnost a linearitu kvantifikace oligonukleotidů (GEM91) v lidské plasmě při nízkých ng/mL úrovních.
• Uplatnit nový vysokovýkonný tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr Xevo TQ Absolute v kombinaci s UPLC ACQUITY Premier.
• Stanovit rozsah a citlivost metody pro polythymidinové řetězce (15–35 mer) a srovnat výsledky pro různé délky oligonukleotidů.

Použitá metodika

• Příprava vzorků: extrakce plasmatu fenol:chloroform:isoamylalkohol a následná chloroformová extrakce s 99% výtěžností.
• Sušení a rekonstituce extraktů v roztoku EDTA (100 µM).
• Chromatografie: gradientní eluce na kolóně Oligonucleotide C18 (1,7 µm, 2,1 × 50 mm), mobilní fáze A: 100 mM HFIP + 15 mM DIPEA ve vodě, fáze B: 100 mM HFIP + 15 mM DIPEA v 90% acetonitrilu, průtok 0,5 mL/min, doba běhu 5 min.
• MS/MS detekce: ESI v režimu negativních iontů, optimalizované parametry kuželu a kolizního napětí, kvantifikační přechody pro jednotlivé oligonukleotidy.

Použitá instrumentace

• Tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr Waters Xevo TQ Absolute.
• UPLC systém Waters ACQUITY Premier.
• Kolona Waters ACQUITY PREMIER Oligonucleotide C18 (1,7 µm, 2,1 × 50 mm).
• Software TargetLynx XS pro akvizici a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrační křivky pro oligonukleotidy 15–35 mer vykázaly linearitu s r² > 0,99 v rozmezí 0,1–10 000 ng/mL.
• Reprodukovatelnost QCs (n = 6) byla lepší než ±15 % (±20 % na LLOQ) během tří po sobě jdoucích dnů.
• Citlivost LLOQ dosáhla 0,1 ng/mL pro GEM91 i polythymidinové standardy, s odezvou analytu více než 5× nad maticovou mezerou.
• Krátké oligonukleotidy (15 mer) vykázaly přibližně dvojnásobnou citlivost oproti délkám 35 mer, přesto byly sub-nanomolární koncentrace dosažitelné i pro 35 mer.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost a spolehlivost kvantifikace negativně nabitých oligonukleotidů v komplexních maticích.
• Rychlá analýza (5 min) vhodná pro rutinní bioanalytická stanovení a farmakokinetické studie.
• Minimalizace vlivu nespecifického vázání díky použití ACQUITY Premier s povrchovou technologií MaxPeak HPS.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření metodiky na jiné typy modifikovaných oligonukleotidů a konjugátů.
• Integrace s vysoce paralelními platformami pro vysokokapacitní skríning.
• Vývoj automatizovaných procesů přípravy vzorků a datové analýzy pro zvýšení throughput.

Závěr

Kombinace UPLC ACQUITY Premier a hmotnostního spektrometru Xevo TQ Absolute přináší robustní, citlivou a rychlou metodu pro kvantifikaci oligonukleotidů v biologických vzorcích. Metoda splňuje přísné požadavky na linearitu, citlivost a reprodukovatelnost, což ji činí vhodnou pro bioanalytické i farmaceutické aplikace.

Reference

1. Suma Veeramachineni, Mark Wrona, Sensitive LC-MS/MS Bioanalytical Quantitation of Antisense Oligonucleotides, Waters Corporation, Application Notes, 720007574, March 2022.
2. Jennifer M Nguyen, Martin Gilar, Brooke Koshel, Michael Donegan, Jason MacLean, Zhimin Li, Matthew A Lauber, Assessing the impact of nonspecific binding on oligonucleotide bioanalysis, Future Science, BIOANALYSIS, Vol. 13, No. 16.