A Complete Workflow Solution for Intact Monoclonal Antibody Characterization Using a New High-Performance Benchtop Quadrupole-Orbitrap LC-MS/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují významnou třídu biologických léčiv a diagnostických nástrojů. Jejich heterogenní povaha vyžaduje detailní charakterizaci pro zajištění kvality, bezpečnosti a reprodukovatelnosti výrobních procesů. Kombinace rychlé chromatografie, vysokého rozlišení a přesného měření hmotnosti přináší komplexní pohled na strukturu intact mAb.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní LC-MS/MS workflow pro kompletní charakterizaci intact mAb. Autoři demonstrovali schopnost měřit molekulovou hmotnost intact i redukovaných řetězců s přesností pod 10 ppm a současně dosáhnout rozsáhlého „top-down“ sekvenování přes 40 % fragmentačních míst pro lehký řetězec.

Použitá metodika

Studie zahrnovala:

• Redukci intact mAb v 6M guanidinu-HCl s DDT při 60 °C.
• Separaci na ProSwift RP-10R monolitické kolonce (1×50 mm) při 80 °C s gradientem 0,1 % formiové kyseliny v H2O a acetonitrilu.
• ESI-MS analýzu intact a redukovaných protilátek na přístrojích Q Exactive s orbitrap detektorem.
• Top-down MS/MS s rozhraním msx HCD pro simultánní detekci fragmentů různých nábojných stavů.
• Datovou dekonvoluci pomocí algoritmu ReSpect™ v Protein Deconvolution 1.0 a sekvenční analýzu v ProSightPC 2.0.

Použitá instrumentace

• LC: Thermo Scientific ProSwift RP-10R monolitická kolona.
• MS: Thermo Scientific Q Exactive benchtop quadrupole-Orbitrap.
• Softwarové nástroje: Protein Deconvolution 1.0, ProSightPC 2.0.

Hlavní výsledky a diskuse

• Přesnost hmotnostního měření intact mAb v průměru <10 ppm, průměrná odchylka 6,9 ppm.
• Identifikace pěti hlavních glykoforem lehkého řetězce s reprodukovatelnou relativní abundancí v rámci několika procent.
• On-line top-down sekvenování lehkého řetězce s pokrytím přes 40 % sekvence, včetně variabilní N-terminální oblasti, s chybou shody fragmentů <5 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený LC-MS/MS workflow umožňuje rychlou a vysoce spolehlivou charakterizaci intact mAb bez nutnosti separace podílů nebo komplexních přípravných kroků. Metoda podporuje QA/QC procesy ve farmaceutickém vývoji, odhaluje varianty glykosylace a kontroluje primární strukturu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že integrace vyššího výkonu orbitrap detektoru a nových multi-kopie fragmentačních režimů dále zlepší sekvenční pokrytí. Aplikace v oblasti biobetters, multifunkčních protilátek či konjugovaných mAb rozšíří využití workflow v personalizované medicíně a rozvoj diagnostických testů.

Závěr

Vyvinuté řešení kombinuje rychlou chromatografii, vysoké rozlišení a přesnost orbitrap MS s výkonnou datovou analýzou, což umožňuje komplexní charakterizaci intact i redukovaných monoklonálních protilátek v jediném workflow.