Top-down Characterization of Monoclonal Antibody on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Intaktní hmotnostní analýza a top down fragmentace monoklonálních protilátek poskytují komplexní pohled na heterogenitu glykosylace, přesné určení modifikací a potvrzení sekvence. Tento přístup je klíčový pro vývoj a kontrolu kvality terapeutických protilátek v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat využití Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer pro:

• intaktní hmotnostní screening protilátky a jejích glykosylovaných forem
• top down charakterizaci IdeS digesovaných subjednotek Fc 2, light chain a Fd
• kombinaci ETD HD, UVPD a CID fragmentace pro maximalizaci pokrytí sekvence

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek byl nejprve deglykosylován pomocí PNGase F a poté digesován proteázou IdeS. Pro subjednotkovou analýzu byla provedena redukce. Kapalinová chromatografie probíhala na UltiMate 3000 RSLC systému s MabPac RP kolonkou (2,1 × 100 mm) při 400 µl/min a teplotě 80 °C. Gradient organického činidla z 20 na 45 procent přes 5 až 29 minut separoval subjednotky.

Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer s elektrospray ionizací byl nastaven pro intaktní hmotnostní analýzu při rozlišení 15 000 a 240 000 (heavy chain). MS/MS fragmentace probíhala následujícími módy:

• ETD HD s AGC cílem 1e6 a dobou reakce 3 až 25 ms
• UVPD s 213 nm Nd :YAG laserem, energií 2,5 µJ na pulz a 10 až 30 pulzy
• CID a HCD s normalizovanou energií 25 procent a 7 až 15 procent

Software BioPharma Finder ReSpect a Xtract kombinovaný s ProSight Lite (tolerance fragmentu 10 ppm) zpracoval data dekonvoluce a mapování sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza protilátky odhalila hlavní glykofor­my s hmotnostní přesností lepší než 1 ppm. Top down fragmentace subjednotek dosáhla sekvenčního pokrytí:

• 76 procent pro Fc 2
• 80 procent pro light chain
• 73 procent pro Fd

ETD HD ukázala závislost distribu­ce fragmentů na délce reakce, UVPD poskytla doplňkové a/x/b/y c/z ionty v závislosti na počtu pulzů, CID přinesla další doplňkové b/y ionty. Pro redukovaný heavy chain byla dosažena sekvenční pokrytí 40 procent kombinací všech fragmentačních módů a bylo dosaženo izotopického rozlišení s přesností pod 2 ppm, včetně detekce dvou deamidací.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou kontrolu glykoforem a modifikací, potvrzení sekvence pro QA/QC fáze ve výrobě protilátek, identifikaci míst konzervativních a nekonzervativních mutací a určení lokalizace připojených lékových konjugátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření integrace vysokorozlišené LC/MS do rutinních QC procesů, automatizace pracovních postupů, využití pokročilých fragmentačních módů jako EThcD, zrychlení zpracování dat s umělou inteligencí a rozšíření aplikací do middle down a peptidového mapování.

Závěr

Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer v kombinaci ETD HD, UVPD a CID top down fragmentací poskytl vysoce přesnou a komplexní charakterizaci monoklonální protilátky. Metoda umožňuje detailní mapování sekvence, identifikaci PTM a spolehlivou QC analytiku v biotechnologii.

Reference

• Sharma S., Houel S., Mullen C., Weisbrod C., Huguet R., Syka J., Horn D., Josephs J., Schwartz J., Zabrouskov V. Top down Characterization of Monoclonal Antibody on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer. Thermo Fisher Scientific Poster Note 64778, 2016.