Characterization of Monoclonal Antibodies and ADCs using a Benchtop Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Biologické léky založené na monoklonálních protilátkách (mAb) a jejich konjugátech (ADC) vyžadují detailní charakterizaci molekulární hmotnosti, glykos­ylace a míst modifikací. Tyto informace jsou klíčové pro kontrolu kvality, bezpečnost i účinnost biote­rapeutik a usnadňují regulato­rní schvalování v biophar­ma průmyslu.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje propojení vysokovýkonné kapalinové chromatografie (HPLC) s vysokým rozlišením Orbitrap hmotnostní spektrometrie pro:

• Určení intactní molekulární hmotnosti mAb (Herceptin®) a ADC (T-DM1®).
• Měření hmotností lehkého a těžkého řetězce redukovaného ADC.
• Kompletní peptidovou mapu T-DM1 s 100% sledovatelností sekvence a lokalizací všech modifikací.

Použitá metodika

Vzorky ADC byly nejprve redukovány DTT, alkylovány IAA a nakonec tráveny chymotrypsinem. Peptidové směsi byly odděleny gradientním eluačním protokolem na Accela HPLC:

• Intactní analýza: BioBasic C4 a C8 kolony, gradient 5–95 % acetonitrilu (0,1 % FA).
• Peptidová mapa: Accucore C18 kolona, gradient 5–95 % acetonitrilu (0,1 % FA).

Hmotnostní spektrometrie probíhala s následujícími parametry:

• In-source CID: 70–80 eV, rozlišení 17 500–70 000, AGC target 3×10^6, scan range 2000–6000 m/z (intaktní) a 350–1200 m/z (peptidová analýza).
• MS/MS režim dd-MS² / dd-SIM s NCE 27, TopN=8, max. IT 250 ms.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific™ Accela™ HPLC systém
• BioBasic™ C4, C8 a Accucore™ C18 chromatografické kolony
• Q Exactive Plus™ Orbitrap hmotnostní spektrometr (Thermo Scientific™)
• Softwary pro analýzu: PepFinder™ v1.0 (peptidová mapa), Protein Deconvolution™ v3.0 (intaktní hmotnosti)

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza odhalila u Herceptinu sedm hlavních glykoforem, odpovídajících datům výrobce. Pro T-DM1 byla vypočtena průměrná hodnota DAR = 3,34. Peptidová mapování ADC dosáhlo 100% sledovatelnosti sekvence a identifikovalo jak očekávané, tak neočekávané modifikace:

• Lysinové zbytky K42 a K103 byly plně modifikovány DM1.
• K190 a K251 vykazovaly modifikaci ~12 %, resp. ~2 %.
• Nízkoabundantní glykofory byly detekovány pouze v peptidové analýze.

Přínosy a praktické využití metody

Tato kombinovaná HPLC-Orbitrap metoda přináší:

• Vysokou přesnost intactní hmotnostní analýzy pro potvrzení DAR a glykosylace.
• Kompletní pokrytí sekvence ADC s lokalizací všech modifikací.
• Reprodukovatelnost a vysokou propustnost vhodnou pro rutinní QA/QC i výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování může zahrnovat:

• Implementaci iontové mobility pro lepší separaci izobarických forem.
• Automatizované datové workflow s umělou inteligencí pro rychlejší interpretaci modifikací.
• Rozšíření aplikace na další bioterapeutika a konjugáty s novými linkerovými technologiemi.

Závěr

Spojením HPLC s Orbitrap hmotnostní spektrometrií a výkonným softwarem lze v biopharma průmyslu dosáhnout komplexní charakterizace mAb a ADC. Metoda nabízí vysokou přesnost intactních hmotností, plné sekvenční pokrytí a jednoznačnou identifikaci modifikací, čímž zajišťuje spolehlivý nástroj pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Zhang X. et al. Characterization of Monoclonal Antibodies and ADCs using a Benchtop Orbitrap Mass Spectrometer. Thermo Fisher Scientific Application Note, 2015.
2. Herceptin® (trastuzumab) and T-DM1® (trastuzumab emtansine) product datasheets, Roche.