Complete characterization of monoclonal antibodies under native and denaturing conditions

Význam tématu

Charakterizace monoklonálních protilátek (mAb) je klíčová pro zajištění jejich bezpečnosti, účinnosti a konzistence během vývoje bioterapeutik. Vysoká mikro- a makro-heterogenita způsobená modifikacemi glykosylace, oxidacemi či disulfidickými vazbami vyžaduje kombinaci analytických přístupů pro detailní pohled na strukturu a proteoformy mAb.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstrovala možnosti celkové charakterizace mAb trastuzumabu za použití jednoho LC-MS systému. Hlavní cíle byly:

• Ověřit přesnost měření hmotnosti intaktního proteinu pod denaturujícími a nativními podmínkami.
• Analyzovat mAb na úrovni podjednotek chemickou redukcí a štěpením enzymem IdeS.
• Potvrdit primární strukturu proteoform pomocí Top-Down a Middle-Down fragmentace.
• Zajistit plné pokrytí sekvence a detekci post-translačních modifikací metodou Bottom-Up (peptidové mapování).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky trastuzumabu byly analyzovány ve třech pracovních postupech:

• Intaktní mAb pod nativními podmínkami (SEC-LC, 50 mM amonný acetát).
• Intaktní mAb pod denaturujícími podmínkami (RP-LC, 0,1 % kyseliny mravenčí).
• Subjednotky: chemická redukce (TCEP) a IdeS trávení + redukce pro získání LC, HC, Fc/2, Fdʹ (RP-LC).
• Peptidové mapování: SMART Digest Trypsin Kit, RP-LC (Acclaim VANQUISH C18), Bottom-Up fragmentace.

Hlavní instrumentace:

• Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer s BioPharma Option (rozsah m/z až 8000, variabilní tlak v Ion-Routing Multipole).
• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC systém (Binary Pump, Split Sampler, Column Compartment).
• Kolony MAbPac SEC-1, MAbPac RP, Acclaim VANQUISH C18.
• Software: Xcalibur 4.2 SP1, BioPharma Finder 4.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza pod nativními podmínkami prokázala baseline-rozlišené glykoformy s hmotnostní přesností 2,2–6,2 ppm. Denaturační měření odhalilo širší spektrální obálku, přičemž mass acc. 1,7–4,8 ppm potvrdila konzistenci odhadů.
Subjednotkové analýzy (chemická redukce, IdeS + redukce) poskytly izotopicky rozlišené spektra LC, HC, Fc/2 a Fdʹ s monoisotopickou hmotnostní odchylkou ≤2 ppm. Top-Down a Middle-Down přístupy dosáhly sekvenčního pokrytí 36–62 % (LC 62 %, HC 36,5 %, Fc/2 52 %, Fdʹ 52 %).
Peptidové mapování přineslo 100% pokrytí sekvence obou řetězců a spolehlivou identifikaci modifikací, např. oxidu methioninu (+15,995 Da) s charakteristickou ztrátou CH₃SOH.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní charakterizace mAb na jednom LC-MS přístroji.
• Vysoce citlivé, přesné a reprodukovatelné výsledky intaktního i podjednotkového měření.
• Jednoduché nastavení díky předdefinovaným šablonám metod v softwaru.
• Rychlá detekce nízkoho množství proteoform a PTM na všech analytických úrovních.

Budoucí trendy a možnosti využití

Směřují k dalšímu zvyšování rychlosti skenování a rozlišení, integraci umělé inteligence pro pokročilou interpretaci dat, automatizaci workflow a rozšíření aplikací na komplexní glykoproteiny či velké proteoformní komplexy.

Závěr

Orbitrap Exploris 480 s BioPharma Option prokázal vynikající výkon pro plnohodnotnou charakterizaci mAb: intaktní hmotnost, podjednotky, Top/Middle-Down a Bottom-Up. Díky jednoduché obsluze, šablonám metod a vysoké kvalitě dat představuje ideální řešení pro moderní biopharma výzkum a kontrolu kvality.

Reference

1. Srzentić K. et al. Anal. Chem. 2014, 86(19):9945–9953.
2. Beck A.; Liu H. Antibodies (Basel). 2019, 8(1):18.
3. Babaly B. J. Chromatogr. B. 2017, 1060:325–335.
4. Fornelli L. Anal. Chem. 2018, 90(14):8421–8429.
5. Sjogren J. et al. Analyst 2016, 141:3114–3125.
6. Srzentić K.; Fornelli L. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2020, 31(9):1783–1802.
7. Toby T. et al. Anal. Chem. 2016, 88(1):499–519.
8. Scheffler K.; Damoc E. Thermo Scientific Application Note 72348 (2017).
9. Pan H. et al. Protein Sci. 2009, 18(2):424–433.
10. Guan Z. et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003, 14:605–613.
11. Widdowson P.; Claydon A.; Buchanan T. Thermo Scientific Application Note 73672 (2020).