Rapidly Advance Quantitative Proteomics with a High-Throughput SWATH® Acquisition Solution

Význam tématu

Microflow chromatografie v kombinaci s SWATH akvizicí představuje klíčový přístup pro urychlení a průmyslovou škálovatelnost kvantitativní proteomiky. Díky zvýšené robustnosti a možnosti zpracování až stovek vzorků za den nabízí alternativu k tradiční nanoflow LC, přičemž udržuje vysokou citlivost a přesnost měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ověřit dopad zkrácených gradientů v mikroflow režimu na počet a kvantitativní přesnost identifikovaných proteinů při SWATH akvizici. Studie porovnala 20minutové a 45minutové chromatografické metody na několika buněčných liniích a zhodnotila možnosti cloudového zpracování dat v platformě OneOmics.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Buněčné lyzáty (HEK293, HeLa, MCF-7, A549, MG132 ošetřené) připravené standardní kitovou metodou S-Trap, digesce trypsinem.
• Naložení 3–5 µg proteinu na injekci.

Chromatografie:

• NanoLC 425 v mikroflow režimu (5 µL/min) v trap/elute konfiguraci.
• Analytický sloupec 0,3×150 mm Phenomenex Omega Polar, teplota 30 °C.
• Gradienty 20 a 45 minut.

Hmotnostní spektrometrie:

• TripleTOF 6600+ s OptiFlow Turbo V zdrojem (SteadySpray micro probe, 25 µm elektrody).
• SWATH akvizice: TOF-MS scan 150 ms + 100 Q1 oken na cyklus.

Zpracování dat:

• OneOmics™ pipeline v SCIEX Cloud.
• Pan Human iontová knihovna, filtrace výsledků na <1 % Peptide FDR a <20 % CV.

Hlavní výsledky a diskuse

• Počet kvantifikovaných proteinů se v průměru lišil méně než o 5 % mezi 20min a 45min metodou.
• Delší gradienty vedly k nárůstu počtu kvantifikovaných peptidů na protein, ale hlavní proteomická krytí zůstala srovnatelná.
• Kvantitativní přesnost (fold change) mezi HEK a HEK_MG132 byla velmi dobře korelována pro oba gradienty.
• Cloudové nástroje umožnily rychlou vizualizaci kvality dat (normalizace, PCA, retention time alignment) a detailní průzkum diferencované exprese (heat mapy, force-directed grafy, Box-Whisker).

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně zvýšená propustnost až do 100 vzorků/den.
• Robustní provoz s minimálním kolísáním retence a iontové intenzity.
• Udržení vysoké kvantitativní přesnosti i při zrychlených gradientech.
• Škálovatelné zpracování dat díky cloudové platformě pro efektivní workflow ve velkých projektech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace strojového učení a automatizované interpretace proteomických dat.
• Rozšíření iontových knihoven pro hlubší biologické pokrytí.
• Další zkracování chromatografických gradientů při zachování kvality dat.
• Propojení cloudových platforem s laboratořními informačními systémy (LIMS) pro plně automatizovaná QA/QC workflow.

Závěr

Studie prokázala, že mikroflow SWATH akvizice na systému TripleTOF 6600+ s OptiFlow zdrojem dokáže zajistit vysokou propustnost a robustnost, aniž by došlo k výraznému poklesu citlivosti či kvantitativní přesnosti. Cloudové zpracování v OneOmics platformě výrazně urychluje analýzu výsledků a podporuje průmyslové proteomické projekty.

Reference

• Microflow SWATH Acquisition for Industrialized Quantitative Proteomics, SCIEX technical note RUO-MKT-02-3637-A.
• Accelerating SWATH Acquisition for Protein Quantitation – Up to 100 Samples per Day, RUO-MKT-02-8432-A.
• OptiFlow™ Interface for TripleTOF 6600 System, RUO-MKT-02-7219-A.
• Single Source Solution for Low Flow Chromatography – OptiFlow Turbo V Source, RUO-MKT-02-9701-A.
• Achieving Very High Reproducibility for Quantitative Proteomics with NanoLC™ 400 Series, RUO-MKT-02-5755-A.
• Fast-Track SWATH Acquisition Data Processing with the SCIEX Cloud, RUO-MKT-02-6969-B.
• In-Solution Protein Digestion for Proteomic Samples protocol, RUO-MKT-02-5438-A.
• SWATH Performance Kit Standard Operating Protocol.
• Rosenberger G et al. Scientific Data 2014;1:140031.