Accelerating SWATH® Acquisition for Protein Quantitation – Up to 100 Samples per Day

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá kvantifikace proteinů je klíčová pro velkoplošné proteomické studie v biomedicínském výzkumu, farmaceutickém vývoji i QA/QC v průmyslové analytice. Kombinace mikroflow kapalinové chromatografie (LC) se SWATH® akvizicí (DIA) na systému TripleTOF® 6600 umožňuje významné zrychlení analýzy při zachování vysoké kvality dat a reprodukovatelnosti.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na:

• Vyhodnocení vlivu délky chromatografického gradientu (5–45 min) na počet kvantifikovaných proteinů pomocí SWATH DIA.
• Optimalizaci SWATH akvizičních parametrů (počet Q1 oken, doba akumulace, nastavení kolizní energie) pro co nejkratší běhy.
• Porovnání výsledků s různě velkými iontovými knihovnami (SWATH Performance Kit SOP vs. Pan Human Library).
• Ověření výkonu na třech různých TripleTOF 6600 přístrojích a různých vzorcích (HEK, K562, kvasnice).

Použitá metodika

Vzorky buněčných lyzátů (HEK, K562, kvasnice) byly digesovány trypsinem a 1 µg proteinu aplikováno na LC-MS.
Chromatografie probíhala v režimu trap/elute při průtoku 5 µl/min s gradienty 5, 10, 20 a 45 minut. Cílem bylo zjistit kompromis mezi rychlostí běhu (< 15 min celkově pro 5min gradient) a výkonem analýzy.
SWATH akvizice byla optimalizována tak, aby co nejrychleji shromažďovala MS/MS spektra s využitím 60–100 Q1 oken na cyklus a akumulačními časy 15–25 ms, přičemž byla testována i modulace kolizní energie (CES on/off).
DIA data se zpracovávala v softwaru PeakView® 2.2 s využitím SWATH microapp a SWATH Replicates Template. Pro porovnání byly použity dvě knihovny iontových dat.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: NanoLC™ 425 System plně přizpůsobená pro mikroflow (5 µl/min), kolony s hybridními elektrodami, teplota řízení 30 °C.
• M hmotnostní spektrometrie: TripleTOF® 6600 s Turbo V™ zdrojem, Accelerator TOF™ analyzátor pro rychlé MS/MS skeny až 66 Hz.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace parametrů ukázala, že i při 5min gradientu (<15min běh) lze spolehlivě kvantifikovat přibližně 1 300 proteinů z komplexních matric při 1 µg náloži. S prodloucením gradientu na 10 a 20 minut vzrostl počet kvantifikovaných proteinů na ~2 100 a 2 500.
Významně se projevil vliv velikosti iontové knihovny: použití rozsáhlé Pan Human Library vedlo k nárůstu o více než 30 % v počtu proteinů a až 75 % v počtu peptidů ve srovnání se standardní knihovnou SWATH Performance Kit.
Mezi přístroji byly výsledky konzistentní – s rozdíly v počtu detekovaných proteinů do 10 %. Počet peptidů byl mezi zařízeními velmi podobný (< 50 % ztráta mezi 45 a 5 min běhy), což potvrzuje robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Tato kombinace mikroflow LC a rychlé SWATH akvizice umožňuje:

• Vyšší přesnost a reprodukovatelnost kvantifikace napříč dávkami vzorků.
• Analýzu až 100 vzorků za den při zachování biologické hloubky pokrytí.
• Flexibilní přechod mezi nanoflow a microflow režimy bez změny hardware.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rychlé LC-MS metody budou dále podporovat velké kohortní studie, farmakoproteomiku a screening biomarkerů. Další vylepšení iontových knihoven, výpočetní analýzy DIA dat a integrace AI-driven optimalizace parametrů mohou zvýšit citlivost a selektivitu. Kombinace s automatizovanými systémy vzorkové přípravy otevře cestu k plně uživatelsky nezávislému high-throughput workflow.

Závěr

Studie demonstrovala, že optimalizované SWATH akviziční parametry na TripleTOF 6600 ve spojení s mikroflow LC umožňují spolehlivé a rychlé kvantifikace proteinů do 5min gradientu. Využití rozsáhlých iontových knihoven dále zvyšuje hloubku proteomického pokrytí. Metoda nabízí robustní řešení pro průmyslové i akademické aplikace vyžadující vysokou propustnost bez kompromisů na kvalitě dat.

Reference

1. Hunter C., Morrice N., Demianova Z. Accelerating SWATH® Acquisition for Protein Quantitation – Up to 100 Samples per Day. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-8432-B, 2018.
2. Microflow SWATH® Acquisition for Industrialized Quantitative Proteomics, RUO-MKT-02-3637-A.
3. Fast Protein Identification Experiments with Microflow LC – Up to 100 Samples per Day, RUO-MKT-02-8312-A.
4. Evolution of SWATH® Acquisition Provides Large Gains in Quantified Proteins, RUO-MKT-02-5772-A.
5. SWATH Performance Kit SOP, SCIEX.
6. Rosenberger G. et al. Extending Depth of Coverage with SWATH® Acquisition Using Deeper Ion Libraries. Scientific Data, 1, 140031, 2014.