Microflow SWATH® Acquisition for Industrialized Quantitative Proteomics

Význam tématu

Data independent acquisition (DIA) spojená s hmotnostní spektrometrií umožňuje rozsáhlé a vysoce reprodukovatelné kvantitativní proteomické analýzy. S narůstajícím počtem vzorků a složitostí biologických matic je klíčové dosáhnout vyšší propustnosti a robustnosti analytických workflow. Mikroflow chromatografie v kombinaci se SWATH Acquisition nabízí řešení pro průmyslové nasazení proteomických studií.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyhodnotit výkonnost mikroflow LC versus klasické nanoflow LC v aplikaci SWATH Acquisition na systému TripleTOF 6600. Studie se zaměřila na hloubku proteomického pokrytí, retenciční stabilitu a propustnost na modelech HEK buněčného lyzátu a lidské plazmy.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: NanoLC 425 systém v mikroflow režimu (5 μL/min) na ChromXP kolóně 0,3×150 mm, gradient 4–32 % acetonitril ve 43 minut, doba analýzy 57 minut, náplň proteinu 1–8 μg.
• Hmotnostní spektrometrie: TripleTOF 6600 se zdrojem Turbo V nebo DuoSpray, variabilní Q1 okna pro SWATH Acquisition, režimy High Sensitivity (HS) a High Resolution (HR).
• Datové zpracování: PeakView 2.2 se SWATH 2.0 a Pan Human SWATH Ion Library, filtrování výsledků na proteiny a peptidy s FDR <1 % a CV <20 %.

Hlavní výsledky a diskuse

• Retenční stabilita: Analýza 48 plazmatických vzorků za 2,5 dne ukázala odchylky retenčního času 4–10 sekund.
• Propustnost: Jedna analýza za 57 minut umožňuje 20–24 vzorků denně (až 150 proteomů týdně).
• Sensitivity loss: Přechod z nanoflow na mikroflow vyžaduje zvýšení dávky proteinu až na 8 μg pro kompenzaci 3–4× nižší citlivosti.
• Optimalizace SWATH: Zvýšení počtu variabilních Q1 oken z 60 na 100 přineslo 15–20 % více kvantifikovaných proteinů; režim HR MS/MS přidal 5–15 % proteinů.
• Výkonnost: Při 8 μg náplně bylo kvantifikováno 4963 proteinů a 30685 peptidů při FDR <1 % a CV <20 %, dynamický rozsah přes 4 řády.
• Srovnání s nanoflow: Mikroflow dosáhl ~85 % proteomického pokrytí nanoflow LC, přičemž propustnost byla 400 % vyšší.

Přínosy a praktické využití metody

Mikroflow SWATH Acquisition zvyšuje robustnost a snadnost obsluhy, snižuje nároky na údržbu a umožňuje rychlé analýzy rozsáhlých souborů vzorků. Metodu ocení studie biomarkerů, QA/QC procesy i průmyslové proteomické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšiřování počtu variabilních oken a zkrácení doby analýzy.
• Automatizace a integrace s pokročilými softwarovými nástroji a umělou inteligencí.
• Rozšíření aplikace na nové typy vzorků, jako jsou tkáňové biopsie nebo single cell proteomika.
• Vývoj nových kolon a ionizačních zdrojů pro zvýšení citlivosti mikroflow LC.

Závěr

Microflow SWATH Acquisition na systému TripleTOF 6600 nabízí vyvážený kompromis mezi vysokou propustností, robustností a hloubkou proteomického pokrytí. Metoda vhodně doplňuje nanoflow přístupy pro náročné průmyslové a výzkumné aplikace.

Reference

1. Improved Data Quality Using Variable Q1 Window Widths in SWATH Acquisition, SCIEX Technical note RUO-MKT-02-2879-A.
2. Evolution of SWATH Acquisition Provides Large Gains in Quantified Proteins, SCIEX Technical note RUO-MKT-02-5772-A.
3. Exploring the Sensitivity Differences for Peptide Quantification in the Low Flow Rate Regime NanoLC 400 System, SCIEX Technical note RUO-MKT-02-3252-A.
4. Rosenberger G et al. Scientific Data 2014 1 140031.
5. Thanks to Yansheng Liu in Ruedi Aebersold’s lab at ETH Zurich for supplying the HEK cell lysate.
6. Accelerating SWATH Acquisition for Protein Quantitation – Up to 100 Samples per Day, SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-8432-A.