Microflow SWATH® Acquisition for Industrialized Quantitative Proteomics

Význam tématu

Analytické proteomické metody založené na hromadné spektrometrii s datově nezávislou akvizicí (DIA) umožňují systematickou a kvantitativní identifikaci tisíců proteinů ve složitých vzorcích. Kombinace SWATH® akvizice a mikroflow kapalinové chromatografie přináší vyšší průchodnost analýz a robustnější provozní podmínky ve srovnání s nanoflow režimy, což je klíčové pro velkoobjemové studií, biomarkerový výzkum a průmyslovou analytiku.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí výkon mikroflow LC v kombinaci se SWATH® akvizicí na systému TripleTOF® 6600. Hlavními cíli bylo porovnat hloubku pokrytí proteomu, robustnost a průchodnost s tradičními nanoflow postupy, optimalizovat chromatografický gradient, nastavení Q1 oken, MS/MS režimy a dávkování vzorku pro dosažení 1hodinové analýzy jedné vzorkové dávky.

Použitá metodika

Separace:

• Trypsinový digest HEK buněčného lyzátu na NanoLC™ 425 systému v režimu přímé injekce.
• ChromXP™ column 0,3×150 mm, gradient 4–32 % organické fáze B během 43 min, průtok 5 µL/min, celkový běh 57 min.
• Proteinové nálože 1–8 µg na kolonu.

Mass spectrometry:

• TripleTOF® 6600 s Turbo V™ nebo DuoSpray® zdrojem a 25 µm hybridními elektrodami.
• SWATH® akvizice s proměnnými Q1 okny navrženými v Analyst® TF Software 1.7.

Data processing:

• SWATH® 2.0 v PeakView® 2.2, Pan Human SWATH Ion Library.
• Filtrování výsledků: <1 % FDR na peptidech, <20 % CV přes pět replikátů.

Použitá instrumentace

• NanoLC™ 400/425 System (SCIEX)
• ChromXP™ 0,3×150 mm kolona (SCIEX)
• TripleTOF® 6600 mass spectrometr (SCIEX)
• Turbo V™ a DuoSpray® ionizační zdroje
• Analyst® TF Software 1.7, PeakView® Software 2.2

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografická robustnost:

• 48 plasmových vzorků během 2,5 dne, retence syntetických peptidů s odchylkami 4–10 s.
• Peak width 10–12 s při poloviční výšce, umožňující úzká retencia okna.

Sensitivity a průchodnost:

• Ztráta citlivosti při přechodu z nanoflow na mikroflow (5 µL/min) ~3–4×, kompenzováno zvýšením nálože na 8 µg.
• Kvantifikace 4500–5000 proteinů v 1 h běhu (5 replikátů, <1 % FDR, <20 % CV).
• Optimalizace počtu Q1 oken (60, 80, 100) vedla ke zvýšení počtu kvantifikovaných proteinů až o 8 % a peptidů o 17 %.
• Vyšší rozlišení MS/MS (>30 000) přineslo navíc 5–15 % kvantifikovaných proteinů.
• Optimální nastavení: 8 µg nálož, 100 proměnných oken, akumulace 25 ms, HR MS/MS – 4963 proteinů, 30 685 peptidů (90 % peptidů <20 % CV) v rozsahu 4 řádů dynamického rozsahu.
• Mikroflow dosahuje ~85 % proteomické pokrytí nanoflow protokolů při čtyřnásobné průchodnosti (24 vzorků/den).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká automatizace a snadná údržba díky vyšším průtokům.
• Průchodnost až 150 analýz proteomu týdně (1 h běhu).
• Robustní kvantitativní výsledky vhodné pro rozsáhlé biomarkerové studie, QA/QC i průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvýšení počtu Q1 oken a rychlosti akvizice.
• Integrace s multiplexními metodami (TMT, DIA-PASEF) a vysoce propustnými formáty (96-well).
• Automatizované návrhy proměnných oken pomocí strojového učení.
• Široké nasazení ve velkých klinických kohortách a průmyslových laboratořích.

Závěr

Microflow SWATH® akvizice na systému TripleTOF® 6600 nabízí vyváženou kombinaci vysoké průchodnosti, robustnosti a kvantitativní kvality. Díky optimalizovaným chromatografickým podmínkám, variabilním Q1 oknům a vysokému rozlišení MS/MS lze v jednohodinovém běhu spolehlivě kvantifikovat téměř 5000 proteinů s nízkou variabilitou, což z metody činí atraktivní volbu pro rozsáhlé proteomické projekty.

Reference

1. SCIEX Technical note RUO-MKT-02-2879-A. Improved Data Quality Using Variable Q1 Window Widths in SWATH® Acquisition.
2. SCIEX Technical note RUO-MKT-02-5772-A. Evolution of SWATH® Acquisition Provides Large Gains in Quantified Proteins.
3. SCIEX Technical note RUO-MKT-02-3252-A. Exploring the Sensitivity Differences for Peptide Quantification in the Low Flow Rate Regime - NanoLC™ 400 System for High Performance Nanoflow and Microflow LC.
4. Rosenberger G. et al. Scientific Data. 2014;1:140031.
5. Yansheng Liu, Ruedi Aebersold’s lab, ETH Zurich. Dodávka HEK cell lysátu.
6. SCIEX Technical note RUO-MKT-02-8432-A. Accelerating SWATH® Acquisition for Protein Quantitation – Up to 100 Samples per Day.