Evolution of SWATH® Acquisition Provides Large Gains in Quantified Proteins

Význam tématu

SWATH® Acquisition je strategie datově nezávislé akvizice (DIA), která umožňuje komplexní a reprodukovatelné kvantitativní zpracování proteomických vzorků. Díky kontinuálním inovacím v oblasti akvizičního schématu, hardwaru i tvorbě iontových knihoven dnes poskytuje výrazně vyšší pokrytí a kvalitu dat než původní implementace z roku 2012.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyčíslit a porovnat přínos jednotlivých vylepšení SWATH akvizice na systémech TripleTOF®, a to při konstantních LC parametrech, instrumentaci a náloži vzorku. Srovnávaly se čtyři konfigurační přístupy: původní 34 pevně daných oken 25 Da, 20 pevně daných oken 20 Da, 60 variabilních oken a dnešní doporučovaných 100 variabilních oken. Data byla zpracována pomocí různě velkých iontových knihoven.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: NanoLC™ 425 v trap-elute režimu, ChromXP™ 0,3×150 cm kolona, gradient 4–32 % acetonitrilu v 43 min při 5 µl/min.
• Mass spectrometry: systémy TripleTOF® 6600 a 5600 s Turbo V™ zdroji a 25 µm hybridními elektrodami; SWATH akvizice řízena v Analyst TF 1.7.
• Zpracování dat: PeakView™ 2.2 (SWATH 2.0) s Excel šablonou pro replikáty; kvantifikace při <1 % FDR a <20 % CV.

Hlavní výsledky a diskuse

• Variabilní Q1 okna podle hustoty m/z výrazně zlepšují poměr signál/šum, zejména při 100 oknech oproti původním 25 Da oknům.
• Při použití 100 variabilních oken a rozsáhlé Pan Human knihovny bylo dosaženo až 300 % nárůstu Kvantifikovaných peptidů a 120 % nárůstu proteinů oproti původní metodě.
• Metoda s 20 pevnými 20 Da okny na omezeném m/z rozsahu (500–900) zaostávala za variabilními přístupy, což potvrzuje potřebu vysokého počtu kvalitních oken.
• Výsledky byly konzistentní mezi platformami 6600 a 5600, potvrzující univerzálnost doporučené strategie.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná SWATH akvizice umožňuje robustní vysokopropustné kvantitativní proteomické studium s lepší citlivostí, přesností a rozsahem pokrytí. Metoda je vhodná pro biomarkerovou validaci, farmaceutický výzkum i průmyslovou QA/QC analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále se očekává integrace adaptivních akvizičních schémat v reálném čase pro dynamickou volbu oken.
• Rozvoj hlubších a specializovaných iontových knihoven (např. PTM-specifické) pro cílené aplikace.
• Automatizace a industrializace microflow SWATH pro velkosériové projekty.
• Využití strojového učení pro optimalizaci extrakce kvantitativních signálů ze SWATH dat.

Závěr

Modifikace SWATH akvizičního schématu, přechod na variabilní okna a vytváření rozsáhlých iontových knihoven přinesly zásadní zvýšení počtu kvantifikovaných proteinů a peptidů. Tyto inovace dále zvyšují spolehlivost a šíři aplikací DIA přístupu v proteomice.

Reference

1. Gillet LC a kol. Mol. Cell. Proteomics, 11(6), 2012.
2. Improved Data Quality Using Variable Q1 Window Widths in SWATH Acquisition, SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-2879-B.
3. Increasing Depth of Coverage in Data Independent Acquisition with Higher Sample Loads and Smaller Q1 Windows, SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-3245-A.
4. Extending Depth of Coverage with SWATH Acquisition Using Deeper Ion Libraries, SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-3247-A.
5. Rosenberger G a kol. Scientific Data, 1, 140031, 2014.
6. Microflow SWATH Acquisition for Industrialized Quantitative Proteomics, SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-3637-A.
7. SWATH Variable Window Calculator, SCIEX Excel tool.