Higher Resolution LC-MS and MS-MS Analysis of Lipid Extracts Using Benchtop Orbitrap-based Mass Spectrometers and LipidSearch Software

Význam tématu

Analýza lipidomů hraje klíčovou roli v biomedicínském výzkumu i v průmyslové analytice, protože lipidové profily odrážejí fyziologický stav buněk a jejich změny v onemocněních (např. rakovina, diabetes). Vysoce přesná separace a identifikace lipidů usnadňuje objev biomarkerů a cílenou medicínu. Kombinace HPLC separace, vysokého rozlišení Orbitrap MS a automatizované databázové interpretace významně rozšiřuje rozsah a jistotu identifikace lipidových druhů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo porovnat výkonnost nového benchtop Orbitrap LC-MS/MS systému (Q Exactive HF) s předchozí generací (Q Exactive Plus) a kvantifikovat vliv nastavení rozlišení v plném skenu (MS1) a rychlosti akvizice MS/MS (dd‑MS2) na počet identifikovaných lipidů v komplexních celkových lipidových extraktech. Studie používala standardizované celkové lipidové extrakty (býčí mozek, srdce, játra a kvasinky) a software LipidSearch pro automatizovanou identifikaci a relativní kvantifikaci.

Použitá metodika a instrumentace

Popis vzorků a přípravy:

• Vzorky: komerční celkové lipidové extrakty (Avanti) z bovinního mozku, srdce, jater a kvasinek.
• Příprava: koncentrace skladových roztoků 2.5 mg/mL v chloroformu; seriální ředění do 1.25 µg/µL až 50 ng/µL v 50:50 methanol:isopropanol.

HPLC separace:

• Systém: Thermo Dionex UltiMate 3000 RSLC.
• Kolonka: Ascentis Express C18, 2.1 × 100 mm, 2.7 µm, 55 °C.
• Mobilní fáze: A = 60:40 acetonitril:voda, B = 90:10 isopropanol:acetonitril; obě fáze obsahují 10 mM ammonium formiátu a 0.1 % kyseliny mravenčí.
• Průtok 260 µL/min, injekční objem 2 µL. Gradient postupný podle publikované metody (počáteční vysoký podíl A s přechodem na vysoký podíl B během ~25 min).

Hmotnostní spektrometry a nastavení:

• Instrumenty: Thermo Q Exactive Plus a Q Exactive HF (Orbitrap‑based).
• Zdroj: HESI, spray voltage ~4.2 kV, sheath gas 35, aux gas 3, S‑lens 50, kapilární teplota 320 °C, heater 300 °C.
• AGC target: MS 1E6, MS2 1E5; MS2 izolační šířka 1 Da; stepped NCE: pozitivní ionizace 25/30, negativní 20/24/28.
• Akvizice: Q Exactive Plus běžel se strategií Top15 dd‑MS2 (MS2 R = 35K v některých režimech), Q Exactive HF umožnil Top20 dd‑MS2 a provoz při vyšších nastaveních MS1 rozlišení.
• Testovaná MS1 rozlišení: Q Exactive Plus (řádově 17.5K–140K), Q Exactive HF (30K, 60K, 120K, 240K podle experimentu).

Software a zpracování dat:

• LipidSearch (MKI) pro automatizovanou identifikaci a relativní kvantifikaci. Databáze obsahuje přes 1.5 milionu predikovaných lipidových prekurzorů a fragmentů.
• Pracovní postup v LipidSearch: detekce píků z raw dat, identifikace kandidátů pomocí přesného m/z (±5 ppm), sladění výsledků mezi běhy (alignment, okno ~0.4 min), extrakce přesných iontových chromatogramů pro kvantifikaci a statistická analýza (t‑testy).

Hlavní výsledky a diskuse

Počet identifikací a vliv rozlišení:

• Vyšší MS1 rozlišení v plném skenu signifikantně zvyšuje počet identifikovaných lipidových druhů. Q Exactive HF provozovaný na vysokém rozlišení (např. 120K) poskytl přibližně o 20 % více identifikací než Q Exactive Plus v porovnatelném experimentu.
• Případné překryvy izobarických/izomerických lipidů (ilustrováno na příkladu LPE 18:1 a LPC 16:0p při m/z ≈ 480.3) vyžadují skutečné rozlišení řádově 40–60K (prakticky nastavení ~60K dává dostatečné rozlišení; vyšší nastavení zlepšuje jistotu ID), zatímco nižší rozlišení vede ke ztrátě minoritních složek.

Rychlost MS/MS akvizice:

• Vyšší rychlost generování MS2 spekter (Top20 vs Top15) umožnila více MS2 záznamů na chromatografický vrchol a tím vyšší míru potvrzených identifikací ve stejném LC běhu.

Složení a kvantifikace extraktů:

• Z komplexních extraktů byly současně identifikovány stovky lipidových druhů v jednom LC‑ddMS2 běhu; při sladění více vzorků se počet unikátních lipidů překročil 1000.
• Kompozice: bovinní srdce a kvasinky dominovaly triacylglyceroly (TG ~61–65 % podle peak‑area). Mozek, játra i kvasinky měly vysoký podíl fosfolipidů jako PC. Tyto rozdíly byly zachyceny při relativní kvantifikaci z MS1 peak area.

Kvalita identifikací:

• LipidSearch poskytuje skóre shody (m‑score) založené na porovnání experimentálních MS2 spekter s predikovanými fragmenty; vysoké rozlišení zlepšuje přesnost měřených m/z jak prekurzorů tak fragmentů a tím i m‑score.

Přínosy a praktické využití metody

• Platforma (RSLC + Orbitrap HF + LipidSearch) umožňuje širokoplošné necilované lipidomické profily s vysokou citlivostí a reprodukovatelností pro biomarker discovery, nutriční studie, toxikologii a průmyslové QA/QC.
• Díky automatizaci identifikace a kvantifikace lze efektivně zpracovat velké sady vzorků bez nutnosti rozsáhlé manuální interpretace MS/MS spekter.
• Rozšířené rozlišení a rychlost MS2 jsou obzvlášť přínosné při analýze komplexních biologických matic, kde jsou minoritní a izobarické lipidy kritické pro biologické závěry.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zlepšení instrumentální rychlosti a rozlišení (např. vyšší scan‑rate při zachování vysokého rozlišení) zvýší pokrytí lipidomu a umožní robustnější kvantifikaci trace složek.
• Integrace pokročilých algoritmů strojového učení do softwaru pro identifikaci fragmentačních vzorů může zvýšit selektivitu a snížit falešné pozitivy.
• Rozšíření databází o experimentálně ověřené fragmentace a stereochemické informace (např. pozice dvojné vazby, acyl‑lokalizace) povede k detailnějšímu mapování lipidových izomerů.
• Standardizace workflow a mezi‑laboratorní validace podpoří využití v klinických studiích a regulované analytice.

Závěr

Studie demonstruje, že kombinace ultrafield Orbitrapu (Q Exactive HF), optimalizované LC separace a databázově orientovaného softwaru LipidSearch umožňuje identifikovat a relativně kvantifikovat stovky lipidových druhů v jedné LC‑MS/MS analýze. Vyšší MS1 rozlišení a rychlejší dd‑MS2 akvizice vedou k významnému nárůstu počtu jistě identifikovaných lipidů (alespoň ~20 % v porovnání s předchozí generací). Tato platforma je vhodná pro rozsáhlé lipidomické studie, kde je potřeba citlivé a automatizované zpracování dat.

Reference

• LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Fahy E. et al., J. Lipid Res. 2009, 50, S9–S14.
• Lipidomics profiling by high‑resolution LC‑MS and HCD fragmentation: characterization of cardiolipins and monolysocardiolipins. Bird S. et al., Anal. Chem. 2011, 83, 940–949.