Increased Throughput and Confidence for Lipidomics Profiling Using Comprehensive HCD MS2 and CID MS2/MS3 on a Tribrid Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Charakterizace lipidů na molekulární úrovni je klíčová pro pochopení biologických procesů a vlivu lipidů v patofyziologii, jako jsou rakovina, kardiovaskulární choroby či metabolické syndromy. Trávení a skladování energií, buněčné signální dráhy a integrita biomembrán závisí na specifických lipidových molekulách. Nutnost komplexní, citlivé a vysoce průchodné metodiky, která během jediné LC/MS analýzy poskytne přesné určení třídy a struktury lipidů (včetně izomerů), je hnací silou současného vývoje v oblasti lipidomiky.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout workflow založené na vysokém rozlišení a přesné hmotnosti (HRAM) pomocí Tribrid Orbitrap Fusion Lumos mass spektrometru, které:

• umožní provést jedno LC/MSn měření v pozitivním a negativním režimu
• zajistí rychlou a citlivou detekci stovek až tisíců lipidových molekul
• umožní kvantifikovat a identifikovat fosfolipidy, triacylglyceroly a jejich izomery

Kombinace HCD MS2 a podmíněného CID MS2/MS3 vzorkování umožňuje získat jak diagnostické fragmenty pro určení lipidových tříd, tak konkrétní informace o molekulárních složkách (řetězcích mastných kyselin).

Použitá instrumentace

Tribridní Orbitrap Fusion Lumos MS přístroj s architekturou Q-OT-qIT kombinuje:

• high-field Orbitrap analyzátor (rozlišení >500 000 FWHM, rychlost až 20 Hz při 15 000 FWHM)
• dual-pressure lineární iontový trap pro CID a HCD fragmentace
• pokročilou kvadrupólovou technologii a iontový routing multipól pro paralelní manipulaci a fragmentaci
• vysokokapacitní přenosovou trubici a elektrodynamický iontový trychtýř pro zvýšení přenosu iontů

Separace probíhala na Dionex UltiMate 3000 RSLC s kolonkou Accucore C18 (2,1×150 mm, 2,6 µm) při gradientu acetonitril/voda a IPA/acetonitril s 10 mM formiátu amonného a 0,1 % kyseliny formiové.

Použitá metodika

Vzorky tvořily:

• standardní extrac ty z vajec (PC)
• boviní srdeční lipidový extrakt
• celkové lipidové extrakty ze tří potravinových talířů

Workflow zahrnuje:

• střídavou akvizici pozitivního a negativního HCD MS2 v Top-speed režimu (1 s cykly)
• podmíněné CID MS2 při detekci diagnostického produktu m/z 184,0733 (PC fragment)
• podmíněné CID MS3 na tři nejintenzivnější HCD fragmenty s neutrálním úbytkem mastné kyseliny plus NH3 pro TG izomery

Data byly zpracovány v software LipidSearch 4.1 SP1 (prekurzorová tolerance 3 ppm, fragmenty 5 ppm, databázové třídy PC, TG, Cer, DG atd.).

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání cyklů 1 s vs. 2,4 s ukázalo, že Fusion Lumos dosahuje stejného počtu lipidových ID i při rychlém 1 s cyklu, což umožňuje střídat polaritu a současně zachovat dostatek datových bodů pro kvantifikaci.
Charakterizace PC:

• HCD MS2 + podmíněný CID MS2 (po detekci m/z 184) v jednom běhu identifikovala 158 molekulárních PC
• oddělené pozitivní/negativní HCD MS2 metody vyžadovaly dvojnásobný průběh a identifikovaly 166 PC
• komplexní workflow (alternující polarita + CID MS2) zvýšilo počet kompletně charakterizovaných PC na 208

Charakterizace TG:

• běžná HCD MS2 neposkytuje dostatek informací pro izomery
• podmíněné CID MS3 na neutrální úbytek MK+NH3 umožnilo rozlišit koelutující isomery TG (např. 14:0_14:0_18:2)

Celkové nasazení komplexního workflow vedlo k ~793 lipidovým ID vs. 585 pomocí standardní HCD MS2.

Přínosy a praktické využití metody

Nové workflow:

• uve z jednoho LC/MS běhu získá data obou polarit
• zkracuje dobu analýzy na polovinu
• zvyšuje důvěru v určení lipidových tříd a molekulárních složení
• umožňuje analýzu biologických i potravinových vzorků s vysokou průchodností a přesností

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• rozšíření automatizace výběru MSn událostí pomocí umělé inteligence
• propojení lipidomiky s dalšími omickými přístupy
• vývoj rychlejších a citlivějších ionizačních zdrojů a fúzní instrumentace
• využití hloubkové statistické analýzy a strojového učení pro lipidová biomarkerová zjištění

Závěr

Představený komplexní LC/MSn přístup na Tribridním Orbitrap Fusion Lumos MS přináší výrazné zvýšení průchodnosti, citlivosti a spolehlivosti lipidové profilace. Jednoanalytová akvizice obou iontových režimů s automatickou výzvou CID MSn fragmentů umožňuje detailní studium fosfolipidů a triacylglycerolů, včetně izomerů, a je aplikovatelná na biologické, potravinové i plantární vzorky.

Reference

1. Kiyonami R. et al. Increased Identification Coverage and Throughput for Complex Lipidomes. Thermo Fisher Scientific App. Note #607.
2. Matyash V. et al. Lipid Extraction by MTBE for High-throughput Lipidomics. J. Lipid Res. 2008, 49, 1137–1146.
3. Peake D.A. et al. Processing of a Complex Lipid Dataset for the NIST Inter-Laboratory Comparison Exercise. ASMS 2015.
4. Michalski A. et al. Mass Spectrometry Based Proteomics Using Q Exactive. MCP 2011.
5. Liebisch G. et al. Shorthand Notation for Lipid Structures Derived from MS. J. Lipid Res. 2013, 54(6):1523–1530.
6. Vaniya A., Fiehn O. Comprehensive Analysis of Food Metabolites and Natural Products Using Eight Metabolomics Platforms. Metabolomics Society 2015.