Robust and Sensitive LC-MS/MS Based Plasma Lipid Profiling on a Thermo Scientific Q Exactive HF-X Mass Spectrometer

Robustní a citlivé LC-MS/MS profilování lipidů v plasmatických vzorcích na Thermo Scientific Q Exactive HF-X

Význam tématu

Lipidy jsou klíčové biomolekuly v metabolismu a buněčném signalování; jejich komplexní a kvantitativní profilace je nezbytná pro studium fyziologie, patofyziologie a biomarkerů. Robustní workflow pro rozsáhlé studií vyžaduje optimalizaci extrakce, chromatografie, ionizace a režimů hmotnostní spektrometrie tak, aby bylo dosaženo vysokého pokrytí lipidových tříd při zachování citlivosti a reprodukovatelnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit kompletní, reprodukovatelné LC-MS/MS workflow pro hluboké profilování lipidů z lidského plazmatu na přístroji Q Exactive HF-X, optimalizovat objem plazmy pro extrakci, parametry zdroje a DDA akvizice a vyhodnotit limity kvantifikace pomocí izotopicky značené standardní směsi SPLASH Lipidomix. Data zpracovávala platforma LipidSearch 4.2.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: komerční lidské plazma (Sigma). Do každého vzorku byl přidán izotopicky značený interní standard SPLASH (Avanti) před extrakcí.
• Extrahování lipidů: chloroform:methanol (2:1), vysušení a rekonstituce do 100 µL roztoku obsahující 7,5 mM kyseliny mravenčí v směsi dichlormethan/MeOH/PrOH (1:2:4) před LC-MS.
• Optimalizace objemu plazmy: hodnoceno 0–80 µL v rámci celkového 200 µL, nejlepší výsledky byly u 80 µL (vyšší počet detekovaných lipidů a lepší citlivost).
• Chromatografie: reversní RPLC na Thermo Accucore C30 (2.1×150 mm, 2.6 µm) při 50 °C. Mobilní fáze A: acetonitril:voda 50:50 s 5 mM kyseliny mravenčí; B: 2‑propanol:acetonitril:voda 85:10:5 s 5 mM kyseliny mravenčí. Uvedený průtok je 325 mL/min (uvedená hodnota pravděpodobně představuje chybný zápis a obvyklá hodnota pro tento typ kolon je µL/min; v originále je tato hodnota uvedena jako 325 mL/min).
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Q Exactive HF‑X v režimu pozitivní/negativní střídavé ionizace. MS1: rozlišení 120 000 (FWHM, 200 m/z). DDA MS/MS: rozlišení 15 000, až 10–15 MS/MS spekter na cyklus (v textu jsou uvedeny obě varianty), izolační šířka 1.0 m/z, stepped NCE 25/30 (pozitivní i negativní), MS AGC target 1e6, MS/MS AGC target 1e5, max inj. čas 60 ms, dynamic exclusion 8 s. Rozsahy scanu: pozitivní 250–1200 m/z, negativní 500–1000 m/z.
• HESI zdroj: sheath gas 35, aux gas 10, spray voltage +3900 V (poz.), −3500 V (neg.), RF lens/ion funnel optimalizováno na 35, kapilární teplota 250 °C, heater 350 °C.
• Vyhledávání a kvantifikace: LipidSearch 4.2, produktové vyhledávání s tolerancí 5 ppm pro prekurzor i fragment. Pravidla pro addukty: pro PC/LPC pouze M+H; pro PE byly odmítnuty sodiované hlavní ionty; pro TG/MG povoleny pouze M+NH4.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace extrakce: extrakce z 80 µL plazmy poskytla nejvyšší detekční úroveň napříč sledovanými lipidy (včetně nízkoodstupňových ceramidů a fosfolipidů). Replikované extrakce pro každý objem ukázaly reprodukovatelnost s CV <25 % pro všechny detekované SPLASH standardy.
• Optimalizace ion transferu: testování kapilární teploty a RF ion funnelu ukázalo, že kapilární teplota 250 °C nijak významně neovlivnila detekci, zatímco RF = 35 představovalo nejlepší kompromis mezi signálem a snížením in‑source fragmentace u citlivých lipidů (např. cholesteryl estery, ceramidy).
• Identifikace a kvantifikace: celkem bylo důvěryhodně identifikováno až 577 lipidů v rámci 13 vybraných lipidových tříd; z toho 515 lipidů bylo kvantifikováno s CV <30 % v obou replikách extrakcí. Příklady počtů podle tříd: PC 156, TG 112, PE 75, SM 67, DG 41, Cer 29, PI 28, PS 13, LPC 36 apod.
• Senzitivita a LOQ: kalibrační řady SPLASH v plazmě ukázaly nízké limity kvantifikace; pro řadu standardů byly LOQ až 3 ng/mL (např. PE 15:0‑18:1(d7), PG 15:0‑18:1(d7), LPC 18:1(d7)). Jiné třídy měly vyšší LOQ (např. PS 15:0‑18:1(d7) ~269 ng/mL). Kritérium LOQ bylo definováno jako nejnižší kalibrační bod s rozdílem <20 % a CV <20 % při triplikátech.
• Datová akvizice: přístup využívající vysoce rozlišené MS1 pro kvantifikaci a DDA MS2 pro strukturální potvrzení poskytl vyvážený kompromis mezi hloubkou pokrytí a kvalitou fragmentačních spekter díky vysoké rychlosti a citlivosti HF‑X platformy.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow umožňuje komplexní profilaci >500 lipidů z malého objemu plazmy (80 µL), což je vhodné pro klinické kohorty a biobanky s omezeným množstvím materiálu.
• Optimalizovaná nastavení snižují in‑source fragmentaci a zvyšují reprodukovatelnost kvantifikace napříč třídami lipidů, včetně labilejších forem jako ceramidy a cholesteryl estery.
• Implementace izotopicky značených standardů (SPLASH) před extrakcí zajišťuje kompenzaci ztrát při extrakci a zlepšuje validitu relativní kvantifikace.
• Metoda je vhodná pro studie biomarkerů, metabolické a lipidomické analýzy v laboratorních, farmaceutických a akademických prostředích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na nestrukturované (deep) lipidomické studie kombinuje DDA s cílenými metodami (PRM/SRM) pro lepší kvantifikaci nízce abundantních analyzů.
• Integrace ion‑mobility separace nebo širšího použití interních standardů pro jednotlivé třídy by mohla zlepšit separaci izomerů a kvantitativní přesnost.
• Automatizace přípravy vzorků a škálování na vysokopropustné workflow umožní aplikaci v rozsáhlých populačních studiích a v klinickém výzkumu.
• Rozvoj bioinformatiky pro lepší anotaci lipidových izomerů a standardizované datové formáty zvýší přenositelnost dat mezi laboratořemi.

Závěr

Studie představuje ověřené LC‑MS/MS workflow na Q Exactive HF‑X, které kombinuje optimalizovanou extrakci z 80 µL plazmy, C30 chromatografii, nastavené HESI parametry a DDA akvizici pro dosažení hlubokého pokrytí lipidomu (>500 detekovaných lipidů) s dobrou reprodukovatelností a nízkými LOQ pro řadu lipidových standardů. Tímto způsobem je metoda vhodná pro rozsáhlé biologické a klinické aplikace vyžadující citlivé a robustní lipidové profilování.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Q Exactive HF‑X hybrid quadrupole‑Orbitrap mass spectrometer (pozitivní/negativní režim).
• Thermo Accucore C30 kolona, 2.1×150 mm, 2.6 µm, 50 °C.
• HESI zdroj s optimalizovanými parametry (sheath gas 35, aux gas 10, spray voltage Pos 3900 V / Neg 3500 V, RF lens 35, capillary 250 °C, heater 350 °C).
• LipidSearch 4.2 pro identifikaci a relativní kvantifikaci.
• SPLASH Lipidomix (Avanti Polar Lipids) jako izotopicky značená interní standardní směs.

Reference

• Tabiwang N. Arrey, Elena Sokol, Angela Criscuolo, Claire Dauly, Alexander Harder; Robust and Sensitive LC‑MS/MS Based Plasma Lipid Profiling on a Thermo Scientific Q Exactive HF‑X Mass Spectrometer; Thermo Fisher Scientific, 2018 (PO65282‑EN 0518S).