Large-Scale Lipid Profiling of a Human Serum Lipidome Using a High-Resolution, Accurate-Mass LC/MS/MS Approach

Význam tématu

Profilování lipidů hraje klíčovou roli v porozumění fyziologii buněk i patofyziologii onemocnění. Lipidy se podílejí na buněčných membránách, energetickém metabolismu a signalizaci, přičemž změny v jejich složení jsou spojovány s chorobami jako diabetes či rakovina. Vzhledem k vysoké chemické a strukturální rozmanitosti lipidů je nezbytné využít vysoce selektivní chromatografii a přesnou hmotnostní spektrometrii pro spolehlivou identifikaci a kvantifikaci lipidových izomerů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit robustní UHPLC–HRAM MS/MS platformu pro komplexní lipidomické profilování lidské séry a plazmy. Použita byla kombinace nového UHPLC Acclaim C30 sloupce (2,1×250 mm, 1,9 µm) a high-resolution Orbitrap hmotnostního analyzátoru Q Exactive HF spolu se softwarovým balíčkem LipidSearch. Pro validaci byly analyzovány čtyři standardizované vzorky (tři lidské séra s různou dietou a jeden plazmatický pool od NIST).

Použitá metodika a instrumentace

• Extrahování lipidů: směs chloroform–methanol–voda s použitím sad deuterovaných interních standardů (Avanti).
• UHPLC parametrizace: Thermo Dionex UltiMate 3000 RSLC, Acclaim C30 sloupec 45 °C; mobilní fáze A = 60:40 acetonitril/voda, B = 90:10 isopropanol/acetonitril, obě s 10 mM formiátu a 0,1 % kyseliny mravenčí; gradient 0–60 min.
• MS/MS analýza: Thermo Q Exactive HF s HESI-II zdrojem v pozitivním i negativním režimu, top15 dd-MS² strategie, rozlišení full-scan 120 000 FWHM, MS² 30 000 FWHM, přesnost <3 ppm.
• Software: LipidSearch 4.1, tolerance prekurzoru a fragmentu ±5 ppm, filtrační kritéria mScore >20, hlavní addukty pro každou lipidovou třídu.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání C30 a komerčních C18 sloupců prokázalo selektivnější separaci geometrických izomerů triglyceridů (TG). Na C30 sloupci bylo detekováno 14 izomerů TG(55:3) oproti 5 na C18. Celkem bylo z lidských sérových/plazmatických vzorků identifikováno a kvantifikováno 973 lipidových molekulárních druhů (ChE, DG, TG, PC, LPC, PE/LPE, PI, Cer, CerG, SM). Kvantifikace vykazovala vysokou přesnost (většina CV <15 %, pro TG izomery <7 %). PCA analýza dat vedla k jasnému rozlišení vzorků dle diety dárců. Příkladem je vyšší zastoupení 18:2/18:3 TG v séru po lněném oleji a snížené hladiny TG po rybím oleji.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma přináší:

• Rozšířené pokrytí lipidomu včetně izomerů.
• Vysoce selektivní separaci složitých lipidových směsí.
• Přesnou kvantifikaci v širokém dynamickém rozsahu.
• Rychlý a automatizovaný workflow vhodný pro biomarkerový výzkum, klinické studie a QA/QC aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Perspektivou je integrace iontové mobility pro další rozlišení izomerů, zkrácení doby analýzy pomocí ultrarychlých gradientů, vývoj nových softwarových nástrojů pro širší lipidovou databázi a aplikace v personalizované medicíně, nutričním výzkumu či environmentální analýze lipidů.

Závěr

Popsaná UHPLC–HRAM MS/MS metoda s C30 sloupcem a Orbitrap Q Exactive HF umožňuje vysokou selektivitu i citlivost pro komplexní lipidomické studie lidské séry a plazmy. Kombinace chromatografického rozlišení izomerů a přesného hmotnostního měření přináší rutinní identifikaci téměř tisíce lipidů v jediném běhu s vynikající reprodukovatelností.

Reference

• Fahy E. et al. LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. J. Lipid Res. 2009, 50, S9–S14. doi:10.1194/jlr.R800095-JLR200
• Xu Q. et al. Separation of cis and trans isomers of crotamiton using an Acclaim C30 column. Thermo Fisher Scientific Application Brief, #138
• Kiyonami R. et al. Increased identification coverage and throughput for complex lipidomes. Thermo Fisher Scientific Application Note, #607
• Johnson W.L. et al. Methods for Changing Peak Resolution in HPLC: Advantages and Limitations. LC/GC, Special Issues, Apr 01 2013
• Bird S. et al. Lipidomics profiling by high-resolution LC-MS and high-energy collisional dissociation fragmentation: focus on characterization of mitochondrial cardiolipins and monolysocardiolipins. Anal. Chem. 2011, 83, 940–949. doi:10.1021/ac102598u
• Isaac G. et al. Lipid profiling of serum samples from calcific coronary artery disease patients using UPLC/TOF-HDMSE and multivariate data analysis. ASMS 2012 Poster
• Kiyonami R. et al. Rapid phospholipid characterization using a novel intelligent workflow on a tribrid orbitrap mass spectrometer. ASMS 2015 Poster
• Peake D.A. et al. Processing of a complex lipid dataset for the NIST Inter-Laboratory Comparison Exercise for Lipidomics Measurements in Human Serum and Plasma. ASMS 2015 Poster