High Throughput Lipid Identification and Quantification Using a Directed HRAM LC-MS-MS approach on a Modified Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Lipidomika poskytuje klíčové informace o biologických procesech a metabolických poruchách, jako jsou diabetes nebo nádorová onemocnění. Schopnost identifikovat a kvantifikovat tisíce lipidových molekul v jediném analytickém běhu zvyšuje rychlost objevování biomarkerů a umožňuje srovnatelné kvantitativní studie mezi laboratořemi. Směs přístupů — kombinace nediagnostického (untargeted) pokrytí s cílenou (targeted) kvantifikací — zvyšuje šanci nalézt nové signifikantní lipidové kandidáty a současně poskytuje odhadované koncentrace pro konkrétní třídy lipidů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní a reprodukovatelný HPLC MS/MS workflow použitelný na Thermo Scientific Q Exactive HF-X, který umožní současně: rozsáhlou (untargeted) identifikaci lipidů a cílené vyhledávání tisíců předdefinovaných lipidových prekurzorů, s odhadovanou kvantifikací identifikovaných druhů v jediném běhu. Studie demonstruje aplikaci na bovinní srdeční extrakt a dvě lidská plazmová vzorky (kontrolní a diabetická) za použití izotopicky značeného interního standardu (SPLASH Lipidomix) a softwaru LipidSearch 4.1 SP2 pro identifikaci a kvantifikaci.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish UHPLC, kolona Accucore C30 (2.1 × 150 mm, 2.6 μm), teplota 45 °C, průtok 260 μL/min. Mobilní fáze A: 60:40 acetonitril/voda; B: 90:10 izopropanol/acetonitril; obě s 10 mM ammonium formiátem a 0,1 % kyseliny formiové. Injekční objemy: 2 μL (bovinní) a 3 μL (plazma).
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Q Exactive HF a Q Exactive HF-X (hybridní kvadrupól-Orbitrap). HF-X využívá jasnější iontový zdroj a lepší přenos iontů do Orbitrapu, což umožnilo kratší doby injekce a vyšší počet identifikovaných lipidů (prům. +18 % oproti HF).
• Akvizice: Řízená (directed) MS/MS akvizice pomocí velkého inkluzního seznamu (inclusion list) generovaného in-silico softwarem LipidSearch. Inclusion list pokrýval ~4074–4089 lipidových prekurzorů ze 14 hlavních lipidových tříd; MS/MS pořadí bylo řízeno intenzitou detekovaných prekurzorů. Příklady parametrů: rozsah MS 250–1200 m/z, rozlišení 120k (FWHM), DD MS2 Top 20, 15k, max inj. čas 35 ms.
• Interní standardy a kalibrace: SPLASH Lipidomix (izotopicky značená směs) přidána před extrakcí; odhadované koncentrace vypočteny relativně k těmto interním standardům pomocí LipidSearch.
• Příprava vzorků: Extrakce lipidu metodou chloroform/metanol/voda, sušení a re-suspenze v IPA/MeOH (1:1). Plazma: 60 μL vzorku + 10 μL SPLASH; bovinní extrakt na 0,5 mg/mL s 1:10 ředěním interního standardu.
• Software: LipidSearch 4.1 SP2 (identifikace, výběr prekurzorů in-silico, kvantifikace), následné filtrace podle hlavních iontů na lipidovou třídu a CV.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace a pokrytí: V jednom směru řízeného LC-MS/MS běhu bylo identifikováno 1244 lipidových molekularních druhů po filtru CV <30 % a významných hlavních iontů. Ze 14 hlavních lipidových tříd bylo pro více než 1100 lipidů odhadnuto koncentraci (přesněji 1144 uváděno v závěrech; 1202 v některých částech výsledků), včetně ChE, DG, LPC, LPE, MG, PA, PC, PE, PG, PI, PS, SM a TG.
• Kvantitativní reprodukovatelnost: Měřené CV pro spiked d7-PE (15:0-18:1(d7), ~830 ng/mL) byly <5–6 % v obou ionizačních módech; celkem 1244 lipidů mělo CV <30 % a tím byly považovány za kvantitativně spolehlivé pro tuto metodiku.
• Citlivost: Pro třídu PE bylo dosaženo LOD/LOQ přibližně 2 ng/mL, přičemž částečný seznam 125 PE druhů ilustruje odhadované koncentrace a rozdíly mezi kontrolní a diabetickou plazmou.
• Výkonnost HF-X vs HF: HF-X s jasnějším iontovým zdrojem dosáhl průměrně o 18 % více identifikací lipidových druhů i přes kratší maximální dobu injekce (35 ms), což podtrhuje přínos lepšího přenosu iontů pro rychlé, řízené MS/MS akvizice.
• Nalezení nízkoabundantních a nových lipidů: Directed přístup umožnil selektivní vyvolání MS/MS pro velmi slabé prekurzory z inclusion listu a zároveň uchoval možnost identifikovat nenavržené (untargeted) lipidy; příklad identifikovaného nízkoabundantního PS (18:0_22:4) na m/z 840.5740 s kvalitním MS/MS spektrem.

Přínosy a praktické využití metody

• Sloučení untargeted a targeted přístupů umožňuje vysokokapacitní screening lipidomů s odhadem koncentrací bez nutnosti opakovaných běhů pro různé seznamy prekurzorů.
• Metoda poskytuje robustní workflows vhodné pro klinické a přeanalytické studie, kde je důležité současně mapovat široké spektrum lipidů a mít kvantitativní údaje porovnatelně mezi vzorky a laboratořemi díky použití standardizovaného SPLASH mixu.
• Umožňuje detekci nízkoabundantních kandidátů, což zvyšuje šance objevu nových biomarkerů a pokrytí lipidového prostoru u komplexních biokompartmentů (plazma, tkáně, buňky, potraviny).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření inkluzních seznamů a jejich dynamická aktualizace podle nových objevů pro větší pokrytí lipidových modifikací a izomerů.
• Integrace s dalšími rozlišovacími technikami, například iontovou mobilitou nebo širšími DIA (data-independent acquisition) režimy, pro lepší rozlišení izomerů a zvýšení identifikační jistoty.
• Standardizace workflow a mezi-laboratorní srovnatelnost pomocí komerčních interních standardů (SPLASH) pro validaci biomarkerů a klinické aplikace.
• Vylepšená automatizace datového zpracování a využití strojového učení pro rychlejší anotaci a prioritizaci lipidových kandidátů podle biologické relevance.
• Možnost nasazení v rutinním QA/QC a v regulovaných prostředích po následné validaci a akreditaci metodiky.

Závěr

Directed HRAM LC-MS/MS workflow na Q Exactive HF-X umožňuje efektivní kombinaci široké (untargeted) identifikace a cílené kvantifikace lipidových druhů v jediném běhu. Metoda dosahuje hlubokého pokrytí lipidomu lidské plazmy (1244 identifikací s CV <30 %), umožňuje odhad koncentrací více než tisíce lipidů díky použití SPLASH interního standardu a vykazuje vysokou reprodukovatelnost a nízké LOD pro PE třídu (~2 ng/mL). HF-X platforma zlepšuje identifikační výtěžnost díky vyšší iontové efektivitě. Workflow je vhodné pro široké spektrum biologických vzorků a dává základ pro další vývoj směrem k standardizovaným, více-laboratorním lipidomickým analýzám.

Reference

• Kiyonami R., Peake D. A., Huhmer A. High Throughput Lipid Identification and Quantification Using a Directed HRAM LC-MS-MS approach on a Modified Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. Thermo Fisher Scientific, 2017.
• SPLASH Lipidomix, Avanti Polar Lipids (uvedeno jako použitý interní standard).
• LipidSearch 4.1 SP2, MKI (software použitý pro identifikaci a kvantifikaci).