Pre-Sliced diaPASEF: Narrowband accumulation in the first timsCell for Ultra-Sensitive Plasma Proteomics

Význam tématu

Masově spektrometrická proteomika umožňuje detekovat a kvantifikovat tisíce proteinů, avšak stanovení velmi nízkých koncentrací v biologických tekutinách s extrémním dynamickým rozsahem (až 10 řádů) zůstává náročné. Zvýšení citlivosti pro nízce abundantní biomarkery (např. cytokinů) má přímý dopad na klinické a výzkumné aplikace, například v oblasti rané diagnostiky, monitorování zánětlivých stavů a farmakokinetiky. Pre-sliced diaPASEF představuje přístup založený na optimalizaci iontové mobility, který cíleně snižuje komplexitu signálu a zvyšuje akumulaci cílových iontů, čímž umožňuje detekci na sub-attomolární úrovni.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit, zda rozdělení širokého iontově-mobilitního pásma g-diaPASEF do úzkých „plátků“ (pre-sliced diaPASEF) a selektivní řízení vstupu iontů do první TIMS buňky zvýší citlivost cílené proteomiky v neodbouraném (undepleted) lidském plazmatu. Autoři porovnali klasický širokopásmový g-diaPASEF s novým postupem využívajícím úzké okno 0,1 1/k0 a sledovali limit detekce a kvantifikační linearitu pro syntetické peptidy nízce abundantních proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava vzorků: digesce plazmy a přídavek syntetických peptidů reprezentujících nízko abundantní proteiny v sérii 1:5 od 10 fmol po 0,64 amol; těžké izotopově značené peptidy ve všech vzorcích při 10 fmol jako interní standard.
• Akvizice: srovnání širokého iontového pásma (0,7–1,4 1/k0) s pre-sliced g-diaPASEF rozděleným do úzkých oken 0,1 1/k0 pokrývajících oblast přibližně 0,7–1,25 1/k0; každé úzké okno bylo zpočátku pořízeno jako samostatný běh.
• Chromatografie: nanoLC gradienty 60, 40, 20 a 10 minut pro vyhodnocení vlivu separačního času na citlivost a kvalitu kvantifikace.
• Vyhodnocení dat: zpracování a kvantifikace v softwaru Skyline.

Použitá instrumentace:

• timsTOF Pro (Bruker) s dvojitým TIMS (Trapped Ion Mobility Separation)
• nanoElute2 nano-HPLC (Bruker)
• Syntetické lehké a těžké peptidy pro cílenou kvantifikaci
• Software pro analýzu: Skyline

Hlavní výsledky a diskuse

• Pre-sliced diaPASEF významně snížil komplexitu spekter v jednotlivých bězích tím, že rozložil celkovou iontovou populaci do úzkých mobilitních oken. V důsledku toho do druhé TIMS buňky vstupovalo méně konkurentních iontů, což vedlo k lepší akumulaci a vyšší intenzitě cílových peptidů.
• Pro vybrané peptidy (příklady IL-18 a IFNA10) autoři zaznamenali až přibližně 4násobné zvýšení citlivosti v porovnání s plným IM rozsahem, což umožnilo identifikaci a kvantifikaci na sub-attomolárních hladinách v neodbourané plazmě.
• Intenzita signálu pro cílové peptidy se v jednotlivých úzkých oknech zvyšovala a dosahovala maxima právě v okně odpovídajícím jejich iontové mobilitě, což potvrzuje selektivní obohacení.
• Kvantitativní linearita byla zachována přes více než 4 řády velikosti, což naznačuje, že zvýšená citlivost nepřišla na úkor kvality kvantifikace.
• Delší chromatografické gradienty (např. 60 min) favorizovaly detekci nízko abundantních peptidů, ale přístup pre-slicing umožňuje také zlepšení citlivosti při kratších gradientech díky snížení iontové konkurence.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení citlivosti pro cílenou proteomiku v komplexních maticích, zejména v neodbourané plazmě, kde vysokoodborné proteiny dominují a maskují signál nízkých koncentrací.
• Možnost detekovat a kvantifikovat klinicky relevantní biomarkery (např. cytokiny) na sub-attomolárních úrovních bez nutnosti immunodeplece nebo dalších komplikovaných přípravných kroků.
• Praktická přínosnost pro klinické studie, biomarker discovery, farmakologii a monitorování léčby tam, kde je potřeba vysoce citlivá a kvantitativně spolehlivá metoda.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření seznamu cílových peptidů a optimalizace rozdělení mobilitních oken pro paralelní pokrytí širšího spektra analytů s minimálním počtem běhů.
• Automatizace přepínání a plánování pre-sliced běhů tak, aby byl workflow efektivní i v režimu vysokopropustného měření.
• Integrace s dalšími přístupy zvyšujícími selektivitu (např. selektivní obohacení peptidů nebo imunosorbce) pro dosažení ještě nižších limitů detekce.
• Využití machine learningu pro predikci optimálních mobilitních oken na základě předchozích dat a sekvencí cílových peptidů.

Závěr

Pre-sliced g-diaPASEF představuje efektivní strategii ke zvýšení citlivosti cílené proteomiky v komplexních vzorcích. Rozdělením iontového mobilitního rozsahu na úzká pásma a selektivním řízením vstupu iontů do TIMS buňky se dosahuje významného zlepšení signálu cílových peptidů při zachování kvantitativní linearity. Metoda umožňuje detekci nízko abundantních biomarkerů v neodbourané plazmě na sub-attomolární úrovni a má široký potenciál pro klinické a výzkumné aplikace. Další práce by se měla zaměřit na rozšíření cílových panelů a zvýšení provozní efektivity.

Reference

Mendes MLM, Marisco R, Schmit PO, Dittmar G. Pre-Sliced diaPASEF: Narrowband accumulation in the first timsCell for Ultra-Sensitive Plasma Proteomics. Bruker / Luxembourg Institute of Health; 2026. Research use only internal application note.