diaPASEF: label-free quantification of highly complex proteomes

Význam tématu

Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii se stále více zaměřuje na kvantifikaci proteinů ve vysoce komplexních vzorcích s co nejvyšší mírou reprodukovatelnosti a senzitivity. Data-independent acquisition (DIA) nabízí systémový přístup bez selektivního vylučování iontů, ale tradiční DIA metody trpí nižší efektivitou využití iontů. Díky zavedení paralelního akumulování a fragmentace (PASEF) s integrovanou iontovou mobilitou přístroj timsTOF Pro umožňuje novou režii nazvanou diaPASEF, která významně zlepšuje iontovou efektivitu, selektivitu a kvantitativní reprodukovatelnost.

Cíle a přehled studie / článku

• Ověřit schopnost diaPASEF provádět label-free kvantifikaci ve složitých proteomech.
• Analyzovat tři modelové proteomy (HeLa, kvasinky, Escherichia coli) smíšené v definovaných poměrech.
• Zhodnotit identifikaci, kvantitativní reprodukovatelnost (CV) a dynamický rozsah metodiky.

Použitá metodika a instrumentace

Peptidové směsi byly připraveny jako tryptické digestáty HeLa, Saccharomyces cerevisiae a Escherichia coli ve poměrech 65:30:5 a 65:15:20. Analýza probíhala na nanosměšovači nanoElute spojeném s hmotnostním spektrometrem timsTOF Pro (Bruker Daltonics) se separací na C18 koloně IonOpticks (25 cm × 75 µm, 1,6 µm) při 50 °C a gradientu 100 minut. Firmware přístroje bylo upraveno pro diaPASEF se 16 skeny po 100 ms v každém cyklu, včetně 1 MS1 skenu a 10 PASEF MS/MS skenů. Pro cílenou extrakci dat byl použit software Spectronaut v.13.6 s podporou iontové mobility, automatickou kalibrací, korekcí interferencí a kontrolou kvality. Experimentální knihovna spekter vznikla analýzou pěti vysokopH frakcí každého proteomu pomocí PASEF a zajišťovala 13 013 skupin proteinů a 136 682 unikátních peptidových sekvencí.

Hlavní výsledky a diskuse

• Průměrná identifikace překročila 8 000 proteinů na vzorek při FDR 1 % a minimálně dvou peptidových hitů, s datovou úplností 95,9 %.
• Dynamický rozsah detekovaných proteinů pokrýval přibližně 5 řádů velikosti koncentrací.
• Reprodukovatelnost kvantifikace byla velmi vysoká: medián CV 6,7 % a 7,2 % na úrovni proteinových skupin a 8,1 % a 8,6 % na úrovni peptidů pro oba vzorky.
• Využití definovaných poměrů mixovaných proteomů umožnilo potvrdit přesnost kvantifikace (log2 poměry odpovídaly očekávaným hodnotám 0 pro HeLa, 1,0 pro Yeast a –2,0 pro E. coli).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká efektivita využití iontů díky diaPASEF umožňuje hlubokou proteomovou krytí i při nízkém množství vzorku.
• Výrazné zlepšení selektivity a snížení „missing value problem“ v porovnání s klasickými DIA režimy.
• Uplatnění v rutinní analýze velkých kohort vzorků v klinické a průmyslové laboratoři pro QA/QC, biomarkerové studie či systémovou biochemii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace diaPASEF do multi-omics přístupů propojením s metagenomikou a metabolomikou.
• Další optimalizace skenovacích režimů pro výzkum posttranslačních modifikací a nízkoabundantních proteinů.
• Vývoj otevřených databázových nástrojů a rozšíření podpory iontové mobility ve všech předních softwarových platformách pro proteomiku.

Závěr

Metoda diaPASEF představuje průlom v oblasti label-free kvantitativní proteomiky díky efektivnímu využití iontů, vysoké selektivitě a výjimečné reprodukovatelnosti. Umožňuje spolehlivou identifikaci více než 8 000 proteinů v jednom 100minutovém běhu, s dynamickým rozsahem pěti řádů a mediánovým CV pod 10 %, což činí přístroj timsTOF Pro ideálním nástrojem pro rozsáhlé kohortní studie a aplikace v biomedicínském a průmyslovém výzkumu.

Reference

• Meier F et al (2019) diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with DIA. bioRxiv doi 10.1101/656207
• Cox J et al (2014) Accurate proteome quantification in large cohorts by matching between runs. Mol Cell Proteomics doi 10.1074/mcp.M113.031591
• Meier F et al (2018) Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) for high-speed proteomics. Mol Cell Proteomics doi 10.1074/mcp.TIR118.000900
• Navarro P et al (2016) Proteomics quality control for large-scale experiments. Nat Biotechnol doi 10.1038/nbt.3685
• Meier F et al (2015) Trapped ion mobility spectrometry and PASEF: a new dimension for shotgun proteomics. J Proteome Res doi 10.1021/acs.jproteome.5b00932