High throughput 4D-Proteomics – Application of dia-PASEF® and the Evosep One for short gradients

Význam tématu

Proteomika se stala klíčovým nástrojem pro detailní analýzu proteomů v biomedicínském výzkumu a klinické praxi. Kombinace Trapped Ion Mobility Spectrometry (TIMS) a Parallel Accumulation Serial Fragmentation (PASEF) na platformě timsTOF Pro přidává čtvrtý rozměr iontové mobility a zásadně zvyšuje citlivost, rychlost i reprodukovatelnost dat.

Cíle a přehled studie

Tento odborný příspěvek prezentuje aplikaci dia-PASEF metody spojené se systémem Evosep One pro analýzu proteomů lidských buněčných vzorků. Cílem je demonstrovat možnost vysoce průkazné kvantifikace až 300 vzorků denně, dosahující identifikace tisíců proteinových skupin během ultrakrátkých LC gradientů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro optimalizovanou analýzu byly využity následující komponenty:

• HPLC: Evosep One se standardními metodami 60, 100, 200 a 300 vzorků za den (SPD)
• Mass spektrometr: Bruker timsTOF Pro s duálním TIMS a dia-PASEF akvizicí
• Příprava vzorku: HeLa buňky, lyze v TFE, redukce DTT, alkylace IAA, tryptická štěpení, SPE C18 čištění
• Datové knihovny: resource-specific knihovna z 24 frakcí pomocí PASEF; projektově specifické knihovny z dia-PASEF dat metod 100–300 SPD; hybridní knihovna pro cílenou extrakci
• Software: Spectronaut v14 s Pulsar vyhledávačem, 1 % FDR na PSM, peptid a proteinové úrovni

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza 200 ng HeLa vzorku pomocí 60 SPD metody umožnila průměrně 39 936 peptidových sekvencí a 5 204 proteinových skupin na jediné injekci. Dále:

• 300 SPD metoda (4,8 minut) identifikovala >10 000 peptidů a >2 000 proteinů
• Čas cyklu dia-PASEF činí 900 ms (1× MS1 + 8× MS2), pokrývá 24 oken 25 Da v m/z–iontové mobilitě
• 94 % proteinových skupin detekováno ve třech technických replikátech
• Reprodukovatelnost CV 20 % pro 81 % a CV 10 % pro 65 % proteinů
• Identifikace až 3 964 peptidů za minutu gradientu

Přínosy a praktické využití metody

Vysoce robustní a rychlá workflow nabízí:

• Vysokou proteomickou pokrytí i při ultrakrátkých bězích
• Vynikající kvantitativní přesnost a nízké CV
• Kompatibilitu s velkokapacitními klinickými projekty

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zvyšování propustnosti přes 300 SPD, zlepšení automatizace přípravy vzorků a rozšíření aplikací do rutinní klinické diagnostiky a personalizované medicíny. Integrace umělé inteligence pro zpracování 4D dat dále posílí výkonnost a interpretaci výsledků.

Závěr

Kombinace timsTOF Pro s dia-PASEF a Evosep One představuje špičkové řešení pro vysoce výkonnou proteomiku, schopné kvantifikovat tisíce proteinů při zachování rychlosti, citlivosti a robustnosti vhodné pro rozsáhlé studiové kohorty.

Reference

1. Meier F et al. (2018). Mol Cell Proteomics. doi:10.1074/mcp.TIR118.000900
2. Meier F et al. (2019). bioRxiv. doi:10.1101/656207
3. Bruker Daltonics (2020). Application Note LCMS-167 dia-PASEF applied on different gradient lengths.
4. Bache N et al. (2018). Mol Cell Proteomics. doi:10.1074/mcp.TIR118.000853
5. Wang et al. (2015). J Proteome Res. 4(6):2397–2403
6. Kelstrup et al. (2018). J Proteome Res. 17(1):727–738
7. Muntel et al. (2019). Mol Omics. 15:348