dia-PASEF® applied on different gradient lengths

Význam tématu

Data-independent acquisition (DIA) v kombinaci s PASEF (Parallel Accumulation–Serial Fragmentation) řeší omezení klasických DDA přístupů tím, že selekce peptidových prekurzorů není závislá na momentální intenzitě signálu. Metoda dia-PASEF zvyšuje reprodukovatelnost, citlivost i hloubku pokrytí proteomu a umožňuje spolehlivou kvantifikaci ve velkých souborech vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo otestovat výkon dia-PASEF na standardních vzorcích lidské HeLa buňky a kvasinek při různých délkách gradientu 30, 60 a 90 minut. Studie sledovala počet identifikovaných peptidů a proteinových skupin, reprodukovatelnost a kvantitativní přesnost.

Použitá metodika

HeLa celulární pelety byly lyzovány trifluoroetanolem a následně štěpeny trypsinem (poměr 1:100). Kvasinkový standard byl připraven podle dodavatele. Peptidy se separovaly na reversed-phase C18 kolonce (25 cm × 75 µm, 1,6 µm) při 50 °C na nanoLC systému nanoElute. Gradient eluce 2–37 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí probíhal při 400 nl/min po 30, 60 nebo 90 minut. Data byla zpracována ve Spectronaut s Pulsar databázovým vyhledávačem a 1 % FDR kontrolou.

Použitá instrumentace

• timsTOF Pro (Bruker Daltonics) s TIMS a PASEF
• nanoElute nanoLC (Bruker Daltonics)
• C18 kolonka IonOpticks 25 cm × 75 µm, 1,6 µm
• Spectronaut (Biognosys) s integrovaným Pulsar vyhledávačem

Hlavní výsledky a diskuse

Pro HeLa při 90 min bylo průměrně identifikováno 97 363 peptidů a 7 678 proteinových skupin. Při 60 min bylo dosaženo 86 821 peptidů a 7 513 proteinů, při 30 min 58 679 peptidů a 6 395 proteinů. Pro kvasinky odpovídaly výsledky 52 370 peptidům a 4 410 proteinovým skupinám (90 min), 43 018 peptidům a 4 344 proteinům (60 min), 30 404 peptidům a 4 032 proteinům (30 min). Reprodukovatelnost byla vynikající, přičemž u většiny proteinů byl medián CV pod 10 %. Cumulativní nárůst identifikací v tripletech byl minimální, což potvrzuje stabilitu metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká hloubka pokrytí proteomu i při zkrácených gradientech
• Výborná reprodukovatelnost mezi replikami
• Efektivní využití iontů pro MS/MS s téměř 100 % duty cycle
• Vhodné pro kohortové studie, QA/QC i vysokoprodukční laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se zkracování gradientů pro ještě vyšší vzorkovou průchodnost, nasazení automatizovaných platforem (např. Evosep One) pro rychlou přípravu a rozšíření projektově zaměřených knihoven dia-PASEF pro různé biologické matice.

Závěr

Metoda dia-PASEF efektivně spojuje výhody DIA a PASEF, umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci tisíců proteinů i při krátkých gradientech a stává se klíčovým nástrojem pro moderní proteomiku.

Reference

• Meier F. et al. bioRxiv (2019) doi:10.1101/656207
• Meier F. et al. Mol. Cell Proteomics (2018) doi:10.1074/mcp.TIR118.000900
• AppNote LC-MS 157, Bruker Daltonics (2019)
• AppNote LC-MS 160, Bruker Daltonics (2019)
• Wang G. et al. J. Proteome Res. (2015) 4(6):2397-2403