Hey, ho, oliGO – Comparison of ion-pairing systems for oligonucleotide analysis with HPLC-UV

Shrnutí: Hey, ho, oliGO – Porovnání iontově párovacích systémů pro analýzu oligonukleotidů HPLC-UV

Význam tématu

Oligonukleotidy (ON) se stávají klíčovými léčivými a výzkumnými nástroji v personalizované medicíně a molekulární biologii. Rostoucí počet terapeutických ON v preklinickém a klinickém vývoji klade vysoké nároky na přesnost, citlivost a průchodnost analytických metod v kontrolních laboratořích. Iontově párovaná reverzní fáze (IP-RP-HPLC) patří mezi nejrozšířenější přístupy pro separaci těchto vysoce polárních a často dlouhých analyzátů, protože použití kladných iontů páru umožňuje zvýšit afinitu ON k nekovalentním interakcím s reverzní fází a tím dosáhnout retenční kontroly a rozlišení i mezi sekvencemi lišícími se o jediný nukleotid.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat dvě běžné IP-RP chromatografické soustavy pro analýzu oligonukleotidů: triethylamin (TEA) s acetamidem (HAc) versus TEA s hexafluoroisopropanolem (HFIP). Autoři testovali separaci tří syntetických ON rozdílné délky (15, 25 a 64 báze) na různých délkách kolony (50, 30 a 10 mm) za účelem posouzení retenčního On/Off mechanismu, chromatografické symetrie, rozlišení a možnosti zkrácení analýzy pro vysokou propustnost.

Použitá metodika

Vzorce: koncentrace ON stanoveny NanoDropem; ON rozpuštěné ve vodě (5–20 mg v závislosti na dostupnosti); uracil použit jako značka pojistného času (dead time). Metody byly vyvíjeny na sepapure oliGO kolonách (3 µm, 120 Å) v šířkách 4.6 mm a délkách 50, 30 a 10 mm. Teplota separace: 60 °C; průtok: 0.75 ml/min; detekce UV při 254 a 260 nm; injekční režim sandwich s mobilní fází methanol : voda a předepsaným gradientem přizpůsobeným délce kolony.

Použitá instrumentace

Seznam použité přístrojové výbavy (výběr):

• Injektor: LH 8.1 Liquid Handler s chlazením a rychlým wash stanicí
• Pumpa: AZURA P 6.1L HPG, nerezová, 10 ml/min
• Detektor: AZURA DAD 6.1L (diode array, 190–1000 nm), UV flow cell 10 mm, 2 µl
• Termostat: AZURA CT 2.1 (pro až 8 HPLC kolony)
• Kolony: Sepapure oliGO 120-3 (50 x 4.6 mm, 30 x 4.6 mm) a precolumn 10 x 4.6 mm
• Software: ClarityChrom 10.1 (stanice a PDA modul)

Hlavní výsledky a diskuse

- Optimalizace iontově-párovacích podmínek:

• Pro HAc/TEA: konečné podmínky 10 mM HAc + 10 mM TEA (pH ~8.5) poskytly dostatečnou retenci, dobré rozlišení a lepší symetrii píků.
• Pro HFIP/TEA: počáteční 100 mM HFIP + 7 mM TEA (pH ~8) byla během optimalizace snížena koncentrace TEA na ~4 mM při zachování podobné retence.

- Retence a pořadí eluce:

• U testovaných vzorků 64-mer elutoval dříve než 25-mer, pravděpodobně kvůli doplňkové hydrofobní modifikaci C12 u 25-mer (linker), která prodlužuje interakce s reverzní fází.
• Metody založené na HFIP vykazovaly mírně kratší retenční časy, zatímco HAc/TEA dávalo lepší tvar píků a srovnatelné rozlišení.

- On/Off mechanismus a zkrácené kolony:

• Transfer metod mezi systémem HAc/TEA a HFIP/TEA na 50 mm kolonu byl možný bez zásadních úprav gradientu.
• Při redukci délky kolony na 30 a 10 mm zůstala retence a rozlišení obecně akceptovatelná pro 64- a 25-mer, avšak 15-mer na 10 mm koloně ztratil retenční chování (nebyla zachycena retence). To naznačuje omezení On/Off mechanismu při velmi krátkých délkách pro nejkratší sekvence bez další optimalizace iontově-párovacích koncentrací nebo gradientu.

- Rychlost a throughput:

• Autoři ukázali možnost separace oligonukleotidů během kratší doby (pod 2 min) na zkrácených kolonách, což podporuje využití v high-throughput prostředích.

Přínosy a praktické využití metody

- HAc/TEA představuje levnější a dobře fungující alternativu k HFIP/TEA pro IP-RP-HPLC-UV analýzu ON, pokud je prioritou kvalita píků a symetrie.
- HFIP/TEA je vhodné, pokud se preferuje mírně rychlejší eluce a nižší retenční časy; HFIP je však obvykle dražší a může komplikovat kompatibilitu s některými povrchovými materiály a hmotnostní spektrometrií (poznámka: tato studie použila pouze UV detekci).
- Metoda na krátkých kolonách (≤30 mm) umožňuje vysokou propustnost pro delší ON, avšak pro velmi krátké sekvence je nutné další ladění metodiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Další optimalizace pro krátké oligonukleotidy: úprava koncentrací iontově-párovacích reagentů, změny pH, jiný organický modifikátor nebo odlišný gradient mohou obnovit retenci 15-mer na krátkých kolonách.
- Integrace s MS: i když studie používá UV detekci, HFIP/TEA často preferovaná pro LC-MS kompatibilitu by měla být testována v kombinaci se sepapure kolony pro potvrzení přenositelnosti mezi detekčními technikami.
- Miniaturizace a automatizace: zkrácené kolony a automatizované injektory umožní vysokopropustné pracovní postupy pro rutinní QC a screening syntéz ON.
- Vývoj stacionárních fází specifických pro ON, které kombinují selektivitu a rychlost, může dále zlepšit rozlišení bez nutnosti silného iontového párování.

Závěr

Studie ukazuje, že oba testované iontově-párovací systémy (HAc/TEA a HFIP/TEA) umožňují účinnou IP-RP-HPLC-UV separaci oligonukleotidů s dobrou rozlišovací schopností. HAc/TEA poskytuje lepší píkovou symetrii a srovnatelné rozlišení za mírně delší retenční časy než HFIP/TEA, který naopak nabízí zkrácenou dobu analýzy. Přenos metod na kratší kolony demonstroval potenciál pro vysokou propustnost, ale ukázal i omezení retenčního On/Off mechanismu u velmi krátkých sekvencí. Celkově se HAc/TEA jeví jako hodnotná, nákladově efektivní alternativa k HFIP/TEA pro UV-detekční aplikace v analýze oligonukleotidů.

Reference

1. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER); Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry.
2. Eckstein F. Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides: What Is Their Origin and What Is Unique about Them? Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2000, 10(2), 117–121.
3. Stein C. M.; Subasinghe C.; Shinozuka K.; Cohen J. S. Physicochemical Properties of Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research 1988, 16(8), 3209–3221.
4. DeVos S. L.; Miller T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics 2013, 10(3), 486–497.
5. Fornstedt T.; Enmark M. Separation of therapeutic oligonucleotides using ion-pair reversed-phase chromatography based on fundamental separation science; Journal of Chromatography Open, Volume 3, 2023, 100079.
6. Lardeux H.; Bagci S.; Gao M.; Holkenjans W.; Pell R.; Guillarme D. Understanding the fundamentals of the on-off retention mechanism of oligonucleotides and their application to high throughput analysis; Journal of Chromatography A, Volume 1739, 2025, 465523.