Getting in the right phase: HILIC for oligonucleotide analysis

Význam tématu

Hydrofobní iontové párování (IP-RPLC) je momentálně standardní technikou pro charakterizaci terapeutických oligonukleotidů, avšak HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) nabízí ortogonální selektivitu, menší závislost na iontově-párovacích činidlech a lepší kompatibilitu s LC–MS. To je zvláště důležité při profilování nečistot (shortmer/longmer), rutinní QC a při metodách, kde je žádoucí alternativní nebo doplňková separace vůči IP-RPLC.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ukázat vhodnost HILIC s netradičním (zwitteriontovým) sulfobetaine chromatografickým plnivem pro analýzu různých oligonukleotidů a porovnat chování metody při přepínání rozměrů kolony a rychlostí průtoku. Studie testovala několik vzorků (oligonukleotidy různých délek a modifikací) a optimalizovala mobilní fázi, gradienty a iontovou sílu, aby se zhodnotila retence, tvar špiček, rozlišení a reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda:

• Mechanismus: HILIC na zwitteriontové sulfobetaine fázi (Eurospher II HILIC).
• Mobilní fáze: acetonitril (organická fáze) a vodná fáze s pufrem; preferováno 50 mM ammoniumacetát. Ammoniumformiát testován jako alternativa, ale acetate vykazoval lepší symetrii a intenzitu signálu.
• Detekce: UV při 260 nm; akceptovatelná kompatibilita s LC–MS díky absenci iontově-párovacích činidel.
• Optimalizované parametry: teplota 30 °C; počáteční vysoký obsah acetonitrilu (typické HILIC podmínky); pufr 50 mM v počátečních experimentech ukázal nejlepší rozlišení.

Vzorky (přehled, ne detailní tabulka):

• 20mer DNA (semi-thioate, 20 bp)
• mHH (RNA, 26 nt, modifikace OMe a palmitát)
• dT24 C12 (DNA 25 nt s C12 linkerem)
• SCR Antisense (RNA 21 nt, určité 3' modifikace)
• 64mer DNA (oxidovaný, 64 nt)

Použitá instrumentace (systém uveden v aplikaci):

• Pumpa: AZURA P 6.1L (stainless steel)
• Autosampler: LH 8.1 Liquid Handler s chlazením a fast wash stanicí
• Detektor: AZURA DAD 2.1L (DAD, 190–700 nm), průtoková kyveta 10 mm, 2 µl
• Termostat: AZURA CT 2.1 (okolí až 85 °C)
• Kolony: Eurospher II 100-3 HILIC – 50 × 4 mm, 30 × 4 mm a guard 5 × 4 mm (sulfobetaine)
• Software: ClarityChrom pro řízení a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Retence a tvar špiček:

• Všechny testované ON byly retenovány na 50 × 4 mm kolonně při počátečním nastavení (G1) s 50 mM ammoniumacetátem. Ke zlepšení tvaru špiček (zejména pro 64mer) a signálu byla upravena gradientní složka (G2) a následně zvýšen průtok (G3).
• 50 mM ammoniumacetát přinesl lepší symetrii a vyšší signál ve srovnání s 20 mM ammoniumformiátem; pravděpodobné příčiny: vyšší iontová síla a odlišný pH/účinek v prostředí vysokého obsahu acetonitrilu, který mění disociační konstanty pufrů.

Škálování a zrychlení metody:

• Přechod z 50 × 4 mm na 30 × 4 mm kolonu a zvýšení průtoku na 1.0 ml/min umožnilo zkrácení doby analýzy z ~35 minut na ~8 minut (redukce ~77 %) při udržení uspokojivého rozlišení pro většinu vzorků.
• Další škálování na guard kolonu 5 × 4 mm vedlo k výrazné ztrátě rozlišení; 64mer zde již nebyl retenován za testovaných podmínek.

Reprodukovatelnost:

• Deset po sobě jdoucích injekcí 20mer na 30 × 4 mm (G4) dalo RSD 0.16 % pro retenční čas a 0.89 % pro plochu špičky, což svědčí o vysoké opakovatelnosti optimalizované metody.

Porovnání s IP‑RPLC:

• IP‑RPLC (ion-pairing) může dosáhnout velmi rychlých analýz (<2 min) díky on/off retenčnímu mechanismu, avšak vyžaduje použití iontově-párovacích činidel (např. TEA, HFIP) což komplikuje LC–MS kompatibilitu a vyžaduje další čištění nebo úpravy.
• HILIC poskytuje ortogonální selektivitu (retence ovlivněna hydrofilicitou, nabitím a interakcemi se stacionární fází), nevyžaduje ion-pair činidla a je lépe kompatibilní s MS. To dělá HILIC vhodným doplňkem k IP‑RPLC, zejména pro impurity profiling a orthogonální analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• HILIC na zwitteriontové sulfobetaine fázi nabízí spolehlivou retenci širšího spektra oligonukleotidů bez iontově-párových činidel, což zjednodušuje přímé napojení na MS a zlepšuje workflow v analytických laboratořích.
• Metoda je použitelná pro rutinní QC, charakterizaci nečistot (oddělení shortmer/longmer) a jako ortogonální technika k potvrzení výsledků získaných IP‑RPLC.
• Možnost škálování délky kolony a průtoku umožňuje přizpůsobení mezi vyšším rozlišením a vysokou propustností analys (throughput).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace HILIC s LC–MS a vývoj optimalizovaných MS‑přátelských pufrů (koncentrace a volba aniontů/kationtů) povede k širšímu užití pro detailní rozbor modifikací a degradací ON.
• Vývoj stacionárních fází se stále lepší kontrolou elektrostatických interakcí (např. další varianty zwitteriontových plniv) by mohl zlepšit retenci dlouhých sekvencí jako 64mer i na kratších kolónách.
• Automatizace přenosu metod mezi dimenzemi kolony a robustní pravidla pro převod gradientů zrychlí zavádění HILIC metod v QC prostředích.
• Komplementární použití HILIC a IP‑RPLC v multi‑dimenzionálních nebo sekvenčních protokolech zajistí komplexnější profilování kvality a nečistot ON léků.

Závěr

HILIC s zwitteriontovým sulfobetaine materiálem představuje praktickou, opakovatelnou a MS‑kompatibilní alternativu k IP‑RPLC pro analýzu oligonukleotidů. Metoda poskytuje ortogonální selektivitu, dostatečnou retenci a možnost značného zkrácení doby analýzy při vhodném škálování kolony a průtoku. Přestože IP‑RPLC umožňuje extrémně rychlé analýzy, HILIC se hodí pro rutinní kontrolu kvality, impurity profiling a jako doplňková technika při komplexním charakterizování ON produktů.

Reference

1. Tutiš L., Ferguson P. D., Benstead D., Clarke A., Heatherington C., Gripton C., Vanhinsbergh C. J., Somsen G. W., Gargano A. F., Ion-Pairing Hydrophilic Interaction Chromatography for Impurity Profiling of Therapeutic Phosphorothioated Oligonucleotides. Anal. Chem. 2025, 97(29), 15717–15726.
2. Lardeux H., D’Atri V., Guillarme D., Recent advances and current challenges in hydrophilic interaction chromatography for the analysis of therapeutic oligonucleotides. Trends Anal. Chem. (TrAC) 2024, 176, 117758.
3. Lardeux H., Guillarme D., D’Atri V., Comprehensive evaluation of zwitterionic hydrophilic liquid chromatography stationary phases for oligonucleotide characterization. J. Chromatogr. A 2023, 1690, 463785.
4. Kramer J., Prüfer M., Wesolowski J., Folmert K., Hey, ho, oliGO – Comparison of ion-pairing systems for oligonucleotide analysis with HPLC-UV. KNAUER VBS0089, 05/2026.
5. Lobue P. A., Jora M., Addepalli B., Limbach P. A., Oligonucleotide Analysis by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography‑Mass Spectrometry in the Absence of Ion‑Pair Reagents. J. Chromatogr. A 2019, 1595, 39–48.