Large scale purification – of oligonucleotides with ion exchange chromatography

Význam tématu

Oligonukleotidová terapie představuje perspektivní směr v lékařském výzkumu i průmyslové výrobě léčiv. Zajištění vysoké čistoty a výtěžnosti je zásadní pro preklinické i klinické aplikace. Ionexová chromatografie jako robustní a snadno škálovatelná metoda umožňuje efektivní separaci nežádoucích vedlejších produktů po chemické syntéze.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje optimalizaci a praktickou aplikaci ionexové chromatografie pro přípravu oligo(dT) v objemech až jednoho litru surového roztoku. Cílem bylo dosáhnout minimálně 95% čistoty a vysoké výtěžnosti přes 90 % při zachování snadné přenositelnosti na průmyslovou výrobní linku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro čištění oligo(dT) byla zvolena anionovýměnná chromatografie za nenaturovaných podmínek v neorganickém pufru na bázi fosfátů a bromidů. Klíčové parametry:

• Chromatografický systém AZURA Prep s ternárním čerpadlem (maximální průtok 220 ml/min) a UV detekcí při 260 nm
• Připravená kolona YMC Pilot, průměr 100 mm, délka 500 mm s pryskyřicí SOURCE 15Q (silný anionex)
• Analytická kontrola: kolona XBridge OST C18 (4,6×50 mm, 2,5 µm), mobilní fáze voda/acetonitril s pufrem
• Dynamický mixér a manuální frakcionace přibližně po 150 ml vzorku

Hlavní výsledky a diskuse

Východiskem bylo surové oligo(dT) s čistotou 89,1 % podle analytického HPLC. Optimalizovaná gradientová eluce při průtoku 130 ml/min umožnila separaci příslušných frakcí. Po spojení vybraných frakcí byla dosažena čistota 95 % a výtěžnost 90 %. Výsledky potvrzují vysokou kapacitu ionexové kolony i za kontinuálního nasycení UV signálu.

Přínosy a praktické využití metody

Výhody navrženého postupu:

• Vysoká separační účinnost a selektivita vůči vedlejším produktům
• Možnost snadného škálování z analytické na preparativní úroveň
• Šetrné podmínky (vodné pufry), ekologičtější než organická mobilní fáze IP‐RP
• Vysoká opakovatelnost a stabilita procesu díky regeneraci pryskyřice

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směry vývoje zahrnují automatizaci frakcionace, optimalizaci pufrů pro modifikované oligonukleotidy a kombinaci ionexu s jinými chromatografickými technikami pro dosažení ještě vyšší čistoty. V praxi lze tento přístup rozšířit na jiné typy terapeutických oligonukleotidů (siRNA, antisense DNA).

Závěr

Ionexová chromatografie se osvědčuje jako robustní a efektivní metoda pro velkosériovou purifikaci oligonukleotidů. Studie prokázala dosažení cílové čistoty 95 % a výtěžnosti 90 % pro oligo(dT), což potvrzuje její vhodnost pro GMP výrobu a výzkumné programy v oblasti terapeutických nukleotidů.

Reference

1. Wood H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nat Rev Neurol 14:570 (2018)
2. Minkner R, Boonyakida J, Park EY, Wätzig H. Oligonucleotide separation techniques for purification and analysis: What can we learn for todays tasks? Electrophoresis 43(23-24):2402–2427 (2022)