Quality control of oligonucleotides using HPLC coupled to UV and MS detection

Význam tématu

Oligonukleotidy představují klíčovou třídu molekul pro základní výzkum i terapeutické aplikace. Spolehlivá a citlivá kontrola kvality oligonukleotidů je nezbytná pro zajištění čistoty API a detekci vedlejších produktů nebo degradantů.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje workflow pro analýzu oligonukleotidu délky 26 nukleotidů (26-mer) použitím IP-RP HPLC s UV detekcí a následným spojením na negativní ESI-MS. Cílem bylo potvrzení přesné hmotnosti, identifikace a kvantifikace běžných nečistot (N-1, depurinace, thioát-oxidace).

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Referenční standard 26-mer na 10 mg/ml, následné 10× ředění na 1 mg/ml a další úprava na 25 nmol/ml.
• Injekce 2 µl (50 pmol) do HPLC.

Chromatografické podmínky:

• Fáze A: 10 mM HFIP + 7 mM TEA ve vodě, fáze B: methanol.
• Gradient 0–35 min: od 100 % A do 0 % A a zpět.
• Průtok 0,5 ml/min, teplota kolony 60 °C.

Detekce:

• UV detekce při 260 nm.
• MS v módu negativní ESI, sken Q1 500–1250 Da, Q1MI pro selektivní iontový monitoring.

Použitá instrumentace:

• HPLC systém KNAUER AZURA P 8.1L, AS 6.1L, DAD 6.1L, CT2.1, software ClarityChrom.
• MS systém Sciex Triple Quad 5500+ QTRAP, software Sciex OS.
• Kolona Waters XBridge Oligonucleotide BEH C18 (50×4,6 mm, 2,5 µm).

Hlavní výsledky a diskuse

UV chromatogram ukázal hlavní špičku oligonukleotidu s dobrou reprdukovatelností plochy a retence. MS TIC prokázalo řadu deprotonovaných stavů z = 7–15, přičemž nejintenzivnější byl z = 13 (m/z 642,94). Deviation hmotnosti vůči teoretické hodnotě byla v rozmezí ±0,1 Da. Pomocí Q1MI byla detekována a kvantifikována nečistoty:

• N-1 (m/z 618,21) s přesností 0,01 Da.
• Depurinované produkty (NDEP) ~6 % vůči hlavní špičce.
• Thioát-oxidované produkty (NPO) ~2 % vůči hlavní špičce.

Přínosy a praktické využití metody

Integrace UV a MS umožňuje:

• Konfirmaci molekulární hmotnosti oligonukleotidu.
• Citlivou detekci a kvantifikaci koelutujících nečistot.
• Robustní QC v GMP prostředí pro terapeutické oligonukleotidy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí rozšíření může zahrnovat:

• MS/MS a MRM experimenty pro vyšší citlivost na nízké úrovně nečistot.
• Využití vysokorozlišovací MS pro detailnější charakterizaci modifikací.
• Automatizaci a ultrarrychlé UHPLC metody pro zvýšení throughput.

Závěr

Popisované spojení IP-RP HPLC-UV s negativní ESI-MS představuje spolehlivou platformu pro komplexní kontrolu kvality oligonukleotidů. Metoda nabízí přesnou konfirmaci hmotnosti a citlivé stanovení běžných vedlejších produktů, čímž podporuje vývoj a výrobu terapeutických oligonukleotidů nejvyšší kvality.

Reference

• Stilianos G. Roussis, Andrew A. Rodriguez, Claus Rentel Determination of individual oligonucleotide impurities by small amine ion pair-RP HPLC MS and MS/MS: n - 1 impurities Journal of Chromatography B 1169 (2021) 122611 doi 10.1016/j.jchromb.2021.122611