Simplified Equilibrium Dialysis and SPE Method For The UHPLC-MS/MS Analysis of Free T4 and Free T3 For Clinical Research

Význam tématu

Měření volných hormonů štítné žlázy (FT4, FT3) je zásadní pro diagnostiku i sledování onemocnění štítné žlázy.
Imunoanalýzy často trpí analytickými interferencemi, zatímco kombinace rovnovážné dialýzy s LC-MS/MS představuje zlatý standard díky vyšší specifitě, avšak je časově náročná.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout zjednodušenou metodu pro klinický výzkum, která zkrátí čas přípravy vzorků a analýzy na jediný pracovní den.
Metoda spojuje rychlou rovnovážnou dialýzu, přípravu pevnou fází (SPE) a rychlou UHPLC-MS/MS analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

• Reagencie: FT4, FT3, 13C6 označené interní standardy, kalibrátory v 50 mM HEPES (1–100 pg/mL), tri-level QC.
• Rovnovážná dialýza: Rapid Equilibrium Dialysis (RED) insert (Thermo Fisher) – 200 µL séra, 400 µL dialyzačního pufru, 5 h při 37 °C a 800 rpm.
• Příprava vzorků: Oasis MAX µElution Plate – přidání interního standardu, mytí, eluace, ředění bez nutnosti odpařování.
• UHPLC: Waters ACQUITY UPLC System, PREMIER HSS T3 kolona, gradient voda/methanol/formic acid, doba analýzy 2,5 min (3,5 min inj-to-inj).
• MS/MS: Waters Xevo TQ Absolute, režim MRM pro FT4, FT3 a interní standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineárnost: koeficient determinace r2 > 0,995 pro rozsah 1–100 pg/mL.
• Preciznost: ≤ 5,0 % CV (dialysát), ≤ 9,6 % CV (sérové QC).
• Senzitivita: LLMI 0,75 pg/mL pro FT4 i FT3, bez významného carry-over.
• Matricový vliv: normalizované faktory 0,96–1,10.
• Interference: albumin, bilirubin, kreatinin, cholesterol, triglyceridy, kyselina močová 85–115 %.
• Přesnost: Passing-Bablok y = 0,9198x + 1,243, Bland-Altman bias 0,07 % oproti CDC HoSt.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální objem vzorku (200 µL séra).
• Kompletní workflow během jednoho dne.
• Vysoká specifita a reprodukovatelnost vhodná pro výzkumné laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace dialyzačního kroku v rámci high-throughput laboratoří.
• Rozšíření metody na jiné endokrinní hormony a klinické markery.
• Integrace do farmakokinetických a farmakodynamických studií.

Závěr

Zjednodušená metoda kombinuje rychlou dialýzu, SPE a UHPLC-MS/MS, nabízí robustní, citlivý a efektivní způsob analýzy volných hormonů štítné žlázy vhodný pro klinický výzkum.