The UPLC™-MS/MS Analysis of Free Thyroxine (FT4) and Free Triiodothyronine (FT3) With a Simplified Equilibrium Dialysis and SPE Workflow for Clinical Research

Význam tématu

Volné formy hormonů štítné žlázy, FT4 a FT3, hrají klíčovou roli v regulaci metabolismu a jsou klíčové pro diagnostiku endokrinologických poruch. Standardní imunochemické metody často trpí nedostatečnou specificitou a interferencemi. Použití rovnovážné dialýzy v kombinaci s UPLC-MS/MS představuje zlatý standard měření volných hormonů, avšak tradiční protokoly jsou časově náročné, často vyžadují noční inkubaci.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlý a jednodenní workflow pro stanovení FT4 a FT3 v lidské séru pro klinický výzkum. Metoda kombinuje zjednodušenou rovnovážnou dialýzu (ED), přípravu vzorku pevnou fází (SPE) a akcelerovanou chromatografii UPLC se senzitivní detekcí na trojčinném kvadrupólu Xevo TQ Absolute. Součástí je i zefektivněná datová analýza pomocí waters_connect a QUAN Review.

Použitá metodika a instrumentace

• Rovnovážná dialýza: 200 µl séra vs. 400 µl HEPES buffer, 37 °C.
• Příprava vzorku: SPE na Oasis MAX µElution destičce, pre-kondicionace MeOH/voda, eluce kyselým roztokem.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class FL, kolona Premier HSS T3 (2,1×50 mm, 1,8 µm), gradient 0,1 % FA v H2O/MeOH–ACN 50:50, 2,5 min.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo TQ Absolute, pozitivní ESI, MRM režim pro FT4, FT3, jejich izotopické interní standardy.
• Datová analýza: waters_connect s QUAN Review Software.

Hlavní výsledky a diskuse

• Preciznost: CV ≤5,0 % pro spiked dialyzáty, ≤9,6 % pro dialyzované sérum.
• Senzitivita: LLoQ 0,97 pmol/l pro FT4 a 1,15 pmol/l pro FT3 (S/N >10, CV ≤20 %).
• Linearita: 1,11–177 pmol/l (FT4) a 1,32–211 pmol/l (FT3), r2 >0,995.
• Náklon a carryover: žádný významný carryover, potlačení matice kompenzováno interním standardem.
• Matrix efekty: potlačení signálu v sérové matrici do 12,4 %, kompenzováno interním standardem; v dialyzátu zanedbatelné.
• Metodické porovnání: srovnání s CDC HoSt Phase 1 (Passing‐Bablok y=0,9198x+1,243, bias 0,07 %) a UK NEQAS ALTM (vysoká odchylka vůči imunoanalýzám, shoda s literaturou).

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní workflow v rámci jednoho pracovního dne bez noční inkubace.
• Vysoká prostupnost vzorků díky krátkému LC běhu (~3,5 min inj-inj).
• Odlišení FT3 od reversního T3 zajišťuje specifitu stanovení.
• Vysoká analytická citlivost umožňuje detekci nízkých koncentrací volných hormonů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Měření FT4 a FT3 pomocí UPLC-MS/MS lze dále rozšířit o další hormonální analýzy, multiplexní testy či aplikaci v personalizované medicíně. Automatizace ED a SPE integrovaná do laboratorních platforem a pokročilé softwarové nástroje pro‐ces‐sing dat dále zkrátí čas analýzy a zlepší reproducibilitu. Trendem je kombinace MS detekce s umělou inteligencí pro predikci a validaci výsledků.

Závěr

Vyvinutá metoda pro stanovení FT4 a FT3 splňuje požadavky klinického výzkumu: vynikající preciznost, nízké LLoQ, široký analytický rozsah a vysokou propustnost vzorků. Srovnání s referenčními metodami potvrdilo její validitu a přesnost. Jednodenní workflow významně zkracuje dobu analýzy bez kompromisů na kvalitě dat.

Reference

1. De Grande L., Van Uytfanghe K., Reynders D., Das B., Faix J., MacKenzie F., Decallonne B., Hishinuma A., Lapauw B., Taelman P., Van Crombrugge P., Van den Bruel A., Velkeniers B., Williams P., Thienpont L.; IFCC Committee for Standardization of Thyroid Function Tests. Standardization of Free Thyroxine Measurements Allows the Adoption of a More Uniform Reference Interval. Clinical Chemistry. 2017;63(10):1585–1593.