Analysis of Free Testosterone in Serum using the Xevo TQ Absolute for Clinical Research

Význam tématu

Analýza volného testosteronu v séru je klíčová pro pochopení hormonálních stavů a vztahu mezi vázanou a biologicky aktivní frakcí testosteronu. Přesné stanovení malého podílu volného testosteronu (méně než 3 % celkového testosteronu) vyžaduje metody s vysokou citlivostí a specifitou. Pro klinický výzkum takových hormonálních parametrů je nutné překonat technické i časové nároky konvenčních postupů, zejména rovnovážné dialýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat rychlou a citlivou metodu LC-MS/MS pro stanovení volného testosteronu v malém objemu séra (200 µL). Studie využívá kombinaci rychlé rovnovážné dialýzy (RED) a následného koncentračního čištění kapalně-kapalnou extrakcí, spojenou s vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií na systému Xevo TQ Absolute.

Použitá metodika a instrumentace

Postup začíná inkubací 200 µL vzorku séra v RED insertu s pufrem HEPES (pH 7,4) při 37 °C po dobu 2 h. Po dialýze je diasylát obsahující volný hormon extrahován kapalně-kapalnou extrakcí do methylterc-butyl-éteru a koncentrován. Suchý zbytek se rekonstituuje v mobilních fázích a 25 µL se vstřikuje do UPLC.

Instrumentace

• Acquity UPLC I-Class PLUS FL System
• Acquity BEH C18 Column, 2,1×100 mm, 1,7 µm, 130 Å
• Xevo TQ Absolute Triple Quadrupole Mass Spectrometer s ESI+ ionizací
• Rapid Equilibrium Dialysis (RED) Inserts a Base Plate

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární rozsah 0,5–650 pg/mL s koeficientem determinace ≥0,995. Nízká mez měřitelného intervalu (LLMI) 0,5 pg/mL byla dosažena při přesnosti ≤20 % a biasu ≤15 %. Nosnost, opakovatelnost i mezi-běhová přesnost byly ≤8,4 % RSD. Neprokázala se významná iontová suprese ani záskoky mezi vzorky. Porovnání s externím QA schématem UK NEQAS u 45 sérových vzorků ukázalo malý negativní bias -7,6 % a dobrou korelaci s metodou ALTM.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost (dolní hranice 0,5 pg/mL) při malém objemu vzorku (200 µL).
• Rychlá příprava vzorku – dialýza za 2 h a příprava 48 vzorků pod 5 h.
• Možnost opakované analýzy díky dostatečnému rekonstrukčnímu objemu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na automatizaci přípravy vzorků, zkrácení doby analýzy a rozšíření metody na další hormony a biomarkery v séru. Integrace s vysokoprocesními platformami a adaptace na klinické diagnostické workflow umožní širší uplatnění v laboratořích zaměřených na endokrinologii a farmakokinetiku.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda s použitím rovnovážné dialýzy a Xevo TQ Absolute poskytuje rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení volného testosteronu v séru. Metoda vykazuje vynikající analytické parametry, nízkou mez detekce, minimální záskoky a dobrou shodu s externími referenčními hodnotami.

Reference

• V původním textu nebyly uvedeny konkrétní literární odkazy.