A LOW-LEVEL ANALYTICAL METHOD FOR THE QUANTIFICATION OF SERUM FREE TESTOSTERONE USING LC-MS/MS FOR CLINICAL RESEARCH

Význam tématu

Volná frakce testosteronu v lidském séru tvoří méně než 3 % celkového testosteronu, přičemž její přesné stanovení je klíčové pro klinický výzkum endokrinních poruch a sledování farmakologických intervencí. Tradiční ekvilibrační dialýza jako referenční metoda čelí technickým omezením, která mohou snižovat spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo navrhnout a validovat rychlou a vysoce citlivou metodu pro kvantifikaci volného testosteronu v séru, využívající kombinaci krátké ekvilibrační dialýzy a LC-MS/MS, s důrazem na nízký limit detekce, vynikající opakovatelnost a soulad s externími kontrolními schématy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívá v těchto krocích:

• Ekvilibrační dialýza: 200 µl séra a 400 µl 52,75 mM HEPES (pH 7,40) na vložce RED, inkubace 2 h při 37 °C a 800 rpm.
• Extrahování kapalina–kapalina: přidání 1,5 ml MTBE, centrifugace, odsátí organické fáze, vysušení pod dusíkem, rekonstituce v 70 µl mobilní fáze A/B (50:50).
• LC-MS/MS analýza: Waters ACQUITY UPLC I-Class se BEH C18 kolonkou (4,5 min běh), mobilní fáze 0,2 mM NH4F ve vodě a methanolu; detekce v režimu MRM na Waters Xevo TQ Absolute.
• Příprava kalibrátorů 1–500 pg/ml v pufru HEPES, triúrovňové QC v odtučněném séru, interní standard testosteron-13C3.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearita v rozsahu 0,5–650 pg/ml (r2 ≥ 0,995).
• Analytická citlivost: LLMI 0,5 pg/ml (≤20 % CV, ≤15 % bias) potvrzená 50 extrakcemi za 5 dní.
• Žádné významné carryover při 500 pg/ml.
• Matrixové efekty: normalizované faktory 1,03–1,07, bez potlačení či zesílení signálu.
• Preciznost: opakovatelnost a celková variabilita ≤ 8,4 % CV (n=25).
• Interference: vyhovující recovery 87,3–114,5 % pro albumin, bilirubin, kreatinin, cholesterol, triglyceridy a kyselinu močovou.
• Přesnost: Demingova regrese y=0,947x–2,869, Bland-Altmanova bias –7,62 % na NEQAS vzorcích (n=45).

Přínosy a praktické využití metody

Díky nízkému limitu detekce, minimálnímu objemu vzorku a krátké době dialýzy (2 h) je metoda ideální pro klinický výzkum, farmakokinetické studie a laboratorní QA/QC programy zaměřené na přesné monitorování volného testosteronu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a miniaturizace ekvilibrační dialýzy pro vyšší průchodnost.
• Multiplexní stanovení dalších steroidů v rámci jediné LC-MS/MS analýzy.
• Integrace vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie a iontové mobility pro širší analytický profil.
• Využití microsamplingových technik (Dried Blood Spot, kapilární odběr) pro snížení objemu vzorku a zjednodušení odběru.

Závěr

Popisovaná LC-MS/MS metoda s rychlou ekvilibrační dialýzou přináší vysokou citlivost, reprodukovatelnost a spolehlivost měření volného testosteronu v séru. Je připravena pro nasazení ve výzkumných laboratořích a podporuje zdravotnický výzkum zaměřený na hormonální regulaci.

Reference

• Balloch S., Calton L. J., Hammond G. A low-level analytical method for the quantification of serum free testosterone using LC-MS/MS for clinical research. Waters Corporation, 2024.