ADLM: A FAST, NOVEL AND ANALYTICALLY SENSITIVE CLINICAL RESEARCH METHOD FOR THE ANALYSIS OF FREE TESTOSTERONE USING UPLC-MS/MS

Analýza volného testosteronu v séru pomocí UPLC-MS/MS

Význam tématu

Volný testosteron představuje méně než 3 % celkového testosteronu v plazmě, přitom je zodpovědný za biologickou aktivitu hormonu. Přesné a citlivé stanovení volné frakce je klíčové pro výzkum hormonálních poruch, monitorování léčby a epidemiologické studie. Tradiční metoda rovnovážné dialýzy je považována za zlatý standard, ale trpí technickými omezeními a vysokou variabilitou.

Cíle a přehled studie

Představený postup má za cíl vyvinout rychlou a vysoce citlivou metodu pro stanovení volného testosteronu v lidském séru vhodnou pro klinický výzkum. Studie demonstruje lineární rozsah, analytickou citlivost a spolehlivost výsledků s ohledem na reprodukovatelnost a shodu s externím referenčním schématem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku se provádí rychlá rovnovážná dialýza (2 h, 37 °C) na zařízeních RED, následná extrakce methyl-terc-butyletherem a rekonstituce ve směsi mobilních fází. Chromatografická separace je zajištěna na kolonti ACQUITY BEH C18 s mobilními fázemi 0,2 mM amonium fluoridem ve vodě a methanolem. Detekce volného testosteronu a interního standardu v MRM režimu probíhá na hmotnostním spektrometru Waters Xevo TQ Absolute.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah metody pokrývá 0,5–650 pg/mL (r2 ≥ 0,995) s dolní mezí měřitelného intervalu 0,5 pg/mL (≤ 20 % RSD, ≤ 15 % bias).
• Žádný významný carry-over z koncentrační úrovně 500 pg/mL do následujících vzorků.
• Matrixové efekty byly eliminovány normalizací pomocí interního standardu (průměrný faktor 1,03–1,07).
• Opakovatelnost a celková přesnost (≤ 8,4 % CV) pro QC vzorky na třech koncentracích.
• Interferenční testy ukázaly zotavení v rozmezí 87–115 % pro běžné endogenní látky.
• Porovnání s NEQAS schématem: Demingova regrese y = 0,947x − 2,869 a průměrný bias − 7,6 % potvrzují dobrou shodu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda vyžaduje pouze 200 µL séra a dosahuje vysoké citlivosti i přes krátký čas dialýzy (2 h). Jednoduchá příprava vzorku, nízký objem, rychlý chromatografický běh (4,5 min) a robustnost dělají postup vhodným pro vysokoprůchodové klinické studie a výzkumné pořady.

Budoucí trendy a možnosti využití

Je možné integrovat automatizovanou přípravu vzorku a multiplexní analýzu dalších steroidních hormonů ve stejném běhu. Dále se očekává rozšíření validací do diagnostické praxe, rozvoj menších a rychlejších UPLC systémů a využití pokročilých software pro simulace rovnovážných procesů.

Závěr

Popsaná UPLC-MS/MS metoda nabízí rychlý, citlivý a reprodukovatelný přístup k analýze volného testosteronu v séru. Vysoká shoda s externími referenčními schématy dokládá její vhodnost pro výzkumné aplikace v endokrinologii a farmakologii.

Reference

Žádné literární reference přímo neuvedeny.