Enhanced Sensitivity and Reproducibility for HLA-Class I & II Immunopeptidomics Utilizing dia-PASEF Workflow

Význam tématu

Analýza immunopeptidů prostřednictvím hmotnostní spektrometrie je klíčová pro pochopení prezentace antigenů a vývoj imunoterapeutik.
DIA-PASEF kombinuje data independent acquisition s iontovou mobilitou, což nabízí vyšší citlivost, reprodukovatelnost a rychlost oproti klasickému DDA přístupu.

Cíle a přehled studie

Cílem byla komparativní evaluace dia-PASEF oproti standardnímu dda-PASEF pro identifikaci HLA třídy I a II peptidů.
Studie porovnává výkon při různém množství buněčného vstupu (1–5 × 10^6 buněk) a různé analytické workflow (library free directDIA+ vs. library based přístup).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: obohacení HLA-I a HLA-II peptidů z IM9 B-lymfocytární buněčné linie.
Separace a detekce:

• nanoElute 2 LC systém
• Bruker timsTOF Ultra 2 se trapped ion mobility spectrometry a QTOF detektorem
• Doba gradientu: 60 min pro dda-PASEF, 45 min pro dia-PASEF
• dia-PASEF schémata optimalizována pro HLA třídu I (33 oken, m/z 100–1700, mobilita 0,68–1,7 1/K0) a třídu II (34 oken, m/z 100–1700, mobilita 0,70–1,3 1/K0)

Dataové zpracování:

• dda-PASEF: Bruker Proteoscape s TIMSrescore algoritmem
• Spectral library: Spectronaut 19 (Pulsar Search)
• Library free directDIA+: Spectronaut 20

Hlavní výsledky a diskuse

DirectDIA+ identifikovalo až 17 000 nonamerů z 5 × 10^6 buněk, zatímco library based přístup dosáhl přibližně 18 500 precursorů a dda-PASEF kolem 15 000 nonamerů.
U HLA-II peptidů byl library based dia-PASEF výkonnější než directDIA+ (dosud neaplikováno directDIA+ pro HLA-II).
Výsledky ukazují vysokou shodu v charge state a délce peptidů mezi metodami, velmi podobné sekvenční motify a vynikající překryv identifikací napříč workflow.
Porovnání MS/MS anotací dokládá ekvivalentní kvalitu spekter mezi dda- a dia-PASEF, včetně diagnostických immoniových iontů.

Přínosy a praktické využití metody

dia-PASEF umožňuje rozšířit pokrytí peptidomu při nižším vzorkovém vstupu a kratších analytických cyklech.
Zvýšená reprodukovatelnost a citlivost usnadňuje aplikace ve výzkumu imunopeptidomiky a farmaceutickém vývoji.
Workflow directDIA+ zkracuje čas potřebný pro tvorbu spektrálních knihoven.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace rychlých iontově mobilitních technik s pokročilými algoritmy strojového učení pro automatizované zpracování.
Rozšíření directDIA+ na HLA-II a jiné posttranslační modifikace.
Možnost aplikace ve vysoce propustných screeningových platformách a klinických studiích.

Závěr

dia-PASEF na platformě timsTOF Ultra 2 nabízí významné zlepšení citlivosti a reproducibility identifikace HLA třídy I a II peptidů.
DirectDIA+ kombinuje vysokou identifikační kapacitu s výhodou library free přístupu a kratším časem analýzy.
Metoda představuje perspektivní nástroj pro immunopeptidomické studie a vývoj imunoterapeutik.