Small-Footprint Capillary UHPLC/MS Technology Significantly Reducing Consumption of PFAS Containing Modifiers for Fast and High-Resolution Separation of Synthetic Oligonucleotides

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy představují klíčové bioterapeutické, diagnostické a výzkumné nástroje. Ion-pairing LC–MS při vysokém pH s použitím HFIP a TEA je standardní přístup pro analýzu aktivních farmaceutických látek a nečistot, avšak HFIP patří mezi per- a polyfluorované látky (PFAS) s negativním dopadem na životní prostředí a laboratoř. Snížení spotřeby těchto modifikátorů je proto žádoucí pro udržitelný provoz.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si klade za cíl převést konvenční standardflow metodu analýzy syntetických oligonukleotidů na mikroprůtokovou kapilární UHPLC/MS platformu. Hlavním cílem bylo drasticky snížit spotřebu HFIP, TEA a organických rozpouštědel při zachování vysokého chromatografického rozlišení a přesnosti hmotnostní analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace:
  • Axcend Focus LC s autosamplerem
  • Agilent Pro iQ Plus (G6170A) s ESI zdrojem
  • OpenLab CDS Acquisition and Data Analysis 2.8
• Parametry LC:
  • Kolona Acquity M-Class HSS T-3 100 mm × 0,15 mm, 1,8 µm
  • Mobilní fáze A: 100 mM HFIP + 15 mM TEA ve vodě
  • Mobilní fáze B: methanol
  • Průtok 2 µL/min, objem injekce 250 nL
  • Gradient: 0–10 min z 20 % na 27 % B, 11–12 min 95 % B, 12,1 min návrat na 20 % B
• Parametry MS:
  • Režim ESI, negativní polarita
  • Teplota sušícího plynu 300 °C, průtok 6 L/min
  • Kapilární napětí 4000 V, nebulizační tlak 15 psi
• Data processing: dekonvoluce hmotnostních spekter v OpenLab CDS

Hlavní výsledky a diskuse

• DNA ladder standard (15–40 mer) byl separován s ostrými chromatografickými píky a měřené hmotnosti odpovídaly očekávaným hodnotám s odchylkou ≤0,8 Da.
• Analýza 103-mer oligonukleotidu prokázala vhodný tvar píků a přesné určení hmotnosti (32394,5 Da; Δ=0,2 Da).
• Studie siRNA terapeutika Givosiran (sense i antisense řetězce) potvrdila správné molekulární hmotnosti s odchylkami <1 Da.
• Srovnání spotřeby rozpouštědel ukázalo >99,5 % redukci HFIP, TEA a methanolu: mikroprůtok 2 µL/min znamená 24–34 µL/run oproti 5500–7500 µL/run u standard flow (500 µL/min).

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení spotřeby PFAS modifikátorů se šetrným dopadem na životní prostředí a laboratoř.
• Zachování vysokého chromatografického rozlišení a přesné hmotnostní stanovení vhodné pro QA/QC a výzkum bioterapeutik.
• Metodu lze aplikovat na široké spektrum syntetických a konjugovaných oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace průtokových systémů pro zvýšení citlivosti a snížení spotřeby.
• Integrace s vysoce výkonnými hmotnostními spektrometry a automatizace pracovních postupů.
• Aplikace na modifikované a značené oligonukleotidy, rozšíření do oblasti nukleotidových léčiv a vakcín.

Závěr

Mikroprůtoková kapilární UHPLC/MS metoda na platformě Axcend Focus LC a Agilent Pro iQ Plus přináší 220× nižší spotřebu HFIP, TEA a organických rozpouštědel při zachování vysoké chromatografické výkonnosti a přesné hmotnostní analýze syntetických oligonukleotidů.

Reference

1. Advancements in the characterisation of oligonucleotides by high performance liquid chromatography-mass spectrometry in 2021: A short review (10.1002/ansa.202100066)
2. Molecular Weight Confirmation of Oligonucleotides Using Agilent LC/MSD XT and OpenLab CDS (5994-7083EN)