Characterization of a synthetic double stranded siRNA using high-resolution mass spectrometry

Význam tématu

Analýza a charakterizace dvojřetězcových siRNA je klíčová pro vývoj moderních terapeutických oligonukleotidů. Tyto molekuly mají potenciál ovlivňovat genovou expresi a nabízejí léčbu řady vzácných i běžných onemocnění. S rostoucí komplexitou sekvencí a nečistot v syntetických vzorcích je nezbytné použít vysoce selektivní a citlivé metody, které zajistí spolehlivou identifikaci, kvantifikaci a strukturální charakterizaci siRNA.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat schopnost separace a detailní charakterizace dvojřetězcového siRNA a jeho diastereomerů pomocí kombinace iontově-párované kapalinové chromatografie (IP-LC) a vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) s datově závislou akvizicí ddMS2. Studie porovnává podmínky denaturující a nondenaturující separace a hodnotí vliv pH, složení mobilních fází a teploty kolony na rozlišení jednotlivých komponent.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografický systém:

• Vanquish Horizon UHPLC s DNAPac RP kolonkou (2.1 × 50 mm, 4 μm)
• Iontově-párované mobilní fáze s HFIP+DIPEA (pH 7,8) a HFIP+TEA (pH 8,9)
• Gradientní eluce při průtocích 200–250 μL/min, teploty kolony 30–70 °C

Hmotnostní spektrometrie:

• Orbitrap Exploris 120 (Full Scan 570–2 000 m/z, rozlišení 120 000)
• ddMS2 Top4 s HCD kolizní energií (15–21 %), rozlišení 30 000
• Software BioPharma Finder 4.1 – workflow pro mapování oligonukleotidů

Hlavní výsledky a diskuse

Podmínky s DIPEA (pH ≈ 8) při 70 °C vedly k denaturaci duplexu a separaci jednotlivých vláken. V chromatogramu se objevily dva hlavní píky odpovídající sense a antisense řetězci, potvrzené vysokou přesností hmotnosti (<2 ppm) a kompletním MS2 pokrytím.

Při použití TEA (pH ≈ 9) a nižší teplotě kolony (30–50 °C) se zachovala struktura duplexu a detekovaly se dva chromatografické píky, reprezentující diastereomery siRNA, včetně minoritního signálu volného sense řetězce. Zvýšení teploty nad 60 °C vedlo ke ztrátě rozlišení diastereomerů.

HRAM ddMS2 data umožnila jednoznačnou identifikaci a úplné mapování obou řetězců v rámci jediné analýzy, což potvrzuje robustnost metody pro komplexní vzorky siRNA.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a citlivá separace sense/antisense oligonukleotidů i jejich diastereomerů
• Spolehlivá identifikace a mapování sekvence s vysoce přesnou hmotnostní spektrometrií
• Možnost optimalizovat podmínky (pH, teplota, iontové párovače) podle požadavků na denaturaci či zachování duplexu
• Vhodné pro vývoj a QA/QC terapeutických siRNA preparátů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace rychlých gradientů a nových iontových párovačů pro zkrácení doby analýzy
• Automatizované workflow v kombinaci s umělou inteligencí pro predikci a detekci neočekávaných modifikací
• Rozšíření aplikace na dlouhé dsRNA a dalších oligonukleotidových modifikací
• Multiplexní analýza směsí siRNA a asRNA v bohatších biologických matrix

Závěr

Metoda spojující iontově-párovanou UHPLC separaci a HRAM ddMS2 na Orbitrap Exploris 120 prokázala vysokou výkonnost při charakterizaci dvojřetězcových siRNA a jejich diastereomerů. Díky flexibilitě mobilních fází a teplotních podmínek je možné optimalizovat denaturující i nondenaturující režimy, což je klíčové pro pokročilou analýzu terapeutických oligonukleotidů.

Reference

1. Bajan S. a kol. RNA-based therapeutics: from antisense oligonucleotide to miRNAs. Cells, 2020, 9, 137.
2. Sutton J.M. a kol. Current state of oligonucleotide characterization using LC-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2020, 31, 1775.
3. Pourshahian S. Therapeutic Oligonucleotides, impurities, degradants, and their characterization by MS. Mass Spectrom. Rev., 2019.
4. Liu H.C. a kol. Oligonucleotide mapping using BioPharma Finder software. Thermo Scientific Application Note 73789 (2020).
5. Liu H.C. a kol. Identification and quantitation of oligonucleotides, impurities, and degradation products. Thermo Scientific Application Note 73870 (2020).