Characterizing the Poly(A) tail in mRNA using Ion-Pairing Reversed-Phase LC/MS (IPRP-LC/MS) and Deconvolution Tools

Charakterizace poly(A) ocasu mRNA pomocí iontově-párové reverzní fáze LC/MS a dekonvolučních nástrojů

Význam tématu

Poly(A) ocas je klíčovou strukturální složkou mRNA ovlivňující stabilitu molekuly, její translaci a odolnost vůči degradaci v cytoplazmě. Přesné stanovení délky a rozložení poly(A) ocasů má přímý význam pro vývoj, kontrolu kvality a formulaci mRNA bioterapeutik i vakcín. Metody, které kombinují enzymatické štěpení s LC/MS a dekonvolucí, umožňují rychlou a citlivou analýzu těchto heterogenních sekvencí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ukázat postup pro měření délky poly(A) ocasu z mRNA (Firefly Luciferase, FLuc) po enzymatickém štěpení RNázou 4 pomocí iontově-párové reverzní fáze LC/MS a softwarové dekonvoluce. Studie demonstruje optimalizaci mobilních fází a iontově-párových činidel s ohledem na potlačení metalických aduktů, potvrzuje reprodukovatelnost metody a určuje rozložení počtu adenosinů v poly(A) ocasu.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

1. Denaturace FLuc mRNA (50 µL, 1 µg/µL) při 90 °C po dobu 5 minut, ochlazení na 4 °C.
2. Přidání master mixu obsahujícího NEBuffer r1.1 a RNázu 4 (250 jednotek). Inkubace při 37 °C po dobu 45 minut.
3. Quenching přidáním muriního inhibítoru a přenesení do LC/MS vialu.

Chromatografie a MS (shrnutí klíčových parametrů):

• Kolona: Altura Oligo HPH-C18, 2.7 µm, 2.1 x 150 mm.
• Mobilní fáze: 10 mM hexylamin (HA) nebo DIPEA s 50 mM HFIP v oblastech vody/methanolu; použití plastových lahví a speciálních víček pro snížení kovových aduktů; kondicionace LC s iontově-párovacím činidlem 4 hodiny.
• Gradient: lineární přechod 20→100 % B (0–26.5 min), následné fáze pro vypláchnutí kolony v acetonitrilu.
• Průtok 0.25 mL/min, teplota kolony 60 °C, on-column nálož 5.5 µg.
• MS: Agilent Jet Stream ESI v negativním módu na Agilent 6230C LC/TOF; rozsah m/z 400–3200; referenční ionty použity pro kalibraci.
• Software: Agilent MassHunter BioConfirm pro dekonvoluci a analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

Detekce poly(A) ocasu:

• Po štěpení RNázou 4 byla poly(A) složka detekována pozdně v chromatografickém gradientu, přičemž dekonvoluované spektrum ukázalo distribuci délky poly(A) v rozmezí 119–128 adenosinů pro analyzované FLuc mRNA.
• Surové m/z spektrum vykazovalo nárůst signálu začínající přibližně při m/z 800, odpovídající signálu z poly(A) fragmentů.

Optimalizace iontově-párového činidla a aduktuje:

• Porovnáním hexylaminu (HA) a DIPEA bylo zjištěno, že HA výrazně snižuje úroveň Na+ adduktů (u standardních oligonukleotidů 1.44–3.78 % s HA vs. 10.4–13.1 % s DIPEA). Nižší adukce zlepšuje kvalitu dekonvoluce a přesnost měření hmotností.
• Nicméně DIPEA v některých případech poskytl vyšší intenzitu signálu pro delší oligonukleotidy (např. 21-mer), což naznačuje kompromis mezi potlačením aduktů a ionizací.

Reprodukovatelnost a kvalita dat:

• System suitability testy na RNA standardu ukázaly retenční časy s RSD < 0.2 % (n=5) a EIC (peak height) RSD < 2 % pro jednotlivé komponenty (14-, 17-, 20-, 21-mer).
• Tato reprodukovatelnost potvrzuje vhodnost nastavení LC/MS pro rutinní aplikace QC a metrologii poly(A) rozložení.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Metoda umožňuje kvantitativně sledovat distribuci délek poly(A) ocasu, což je důležité pro posouzení kvality mRNA léčiv a vakcín, kde délka ocasu ovlivňuje expresi a stabilitu.
• Enzymatické štěpení RNázou 4 dává cílené štěpy (štěpí po uridinu následujícím purinem), což usnadňuje získání analyzovatelných fragmentů poly(A) a snižuje komplexitu směsi produktů.
• Optimalizace iontově-párovacích podmínek minimalizuje aduktaci kovů a zlepšuje přesnost dekonvoluovaných hmotností.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje a rozšíření aplikací:

• Integrace vysoce rozlišených hmotnostních analyzátorů a rychlejších dekonvolučních algoritmů pro jemnější rozlišení heterogenity poly(A) a detekci modifikací.
• Automatizace předanalytických kroků a standardizované system suitability procedury pro rutinní kontrolu kvality ve výrobě mRNA léčiv.
• Vývoj alternativních iontově-párových reagentů či adukt-snižujících additiv pro zlepšení citlivosti bez ztráty kvality spektra.
• Komplementární použití sekvenčních přístupů (např. MS/MS nebo hybridní sekvenování) pro lokalizaci modifikací a přesné mapování hranic poly(A) ocasu.
• Rozšíření metodiky do regulovaných prostředí pro release testing a stability studií mRNA produktů.

Závěr

Prezentovaná metoda spojení RNázy 4 štěpení s iontově-párovou RP-LC/MS a dekonvoluční analýzou umožňuje spolehlivě detekovat a popsat distribuci délek poly(A) ocasu v mRNA. Optimalizace iontově-párovacího činidla (hexylamin vs. DIPEA) významně ovlivňuje úroveň kovových aduktů a signálovou intenzitu, přičemž výsledné podmínky poskytují vysokou reprodukovatelnost analýzy vhodnou pro aplikace v QC mRNA bioterapeutik.

Reference

1. D’Ascenzo L., Popova A.M., Abernathy S., Sheng S., Limbach P.A., Williamson J.R. Pytheas: a software package for the automated analysis of RNA sequences and modifications via tandem mass spectrometry. Nat. Commun. 2022, 13:2424. doi: 10.1038/s41467-022-30057-5.
2. Gau B.C., Dawdy A.W., Wang H.L., Bare B., Castenada C.H., Friese O.V., Thompson M.S., Lerch T.F., Cirelli D.J., Rouse J.C. Oligonucleotide mapping via mass spectrometry to enable comprehensive primary structure characterization of an mRNA vaccine against SARS-CoV-2. Sci Rep. 2023, 13:9038.