Oligo Purity Analysis and Sequence Confirmation by LC/MS without Ion Pairing Reagents — Sample to reports in about 5 minutes

Význam tématu

Analýza čistoty a potvrzení sekvence oligonukleotidů je klíčová v biotechnologii, farmaceutickém výzkumu a kvalitativní kontrole syntetizovaných nukleových kyselin. Tradiční metody LC/MS s iontově párovacími činidly přinášejí problémy s přetrvávajícími rezidui a zvýšenou náročností údržby přístrojů. Rychlá HILIC chromatografie bez použití iontově párovacích reagentů nabízí alternativu s vyšší propustností a flexibilitou.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit ultrarychlou spojení LC/HILIC a Q-TOF MS pro analýzu přibližně 20 nukleotidových oligonukleotidů během jedné minuty. Studie hodnotí kvalitu měření hmotnosti, schopnost detekce nízkoabundantních nečistot a úplné pokrytí sekvence prostřednictvím automatizované MS/MS akvizice a softwarové analýzy v Agilent MassHunter BioConfirm.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrarychlá chromatografie:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC systém
• InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z UHPLC kolona (2.7 µm, 2.1×5 mm)
• Mobilní fáze A: 90 % acetonitril, 10 % voda + 15 mM acetát amonný
• Mobilní fáze B: 10 % acetonitril, 90 % voda + 15 mM acetát amonný
• Gradient 45→75 % B za 0.4 min, průtok 0.6→1.75 mL/min, celkový čas 1 min

MS nastavení:

• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI
• Negativní iontová polarita
• MS1 rozsah 400–3200 m/z, 4 spektra/s
• Auto MS/MS až 3 prekurzory na cyklus, rozsah 100–2500 m/z, 1 spektrum/s, CE 15–30 V

Softwarová analýza:

• Agilent MassHunter BioConfirm 12.0 pro automatickou dekonvoluci, detekci nečistot a potvrzení sekvence

Hlavní výsledky a diskuse

Massová přesnost pro cílové oligo sekvence dosahovala průměrně 1 ppm. Byl detekován a identifikován řadu nízkoabundantních nečistot (<0.2 %), včetně depurinací a depyrimidinací. Automatizovaná MS/MS akvizice zajistila 100% pokrytí sekvence pro všechny testované oligonukleotidy (18–21mer). Chromatografické píky měly šířku cca 6 s. Po 50 injekcích bylo potvrzeno minimální kolísání tlaku a zachovaná retence různě dlouhých vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Ultrarychlá analýza s celkovou dobou vzorek–report ≈5 min
• Odstranění potřeby iontově párovacích činidel s redukcí rizika kontaminace
• Vysoká propustnost a automatizace vhodné pro QA/QC a rutinní laboratoře
• Možnost detekce stopových nečistot v syntetických oligo produktech

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na modifikované a delší oligonukleotidy, RNA sekvence
• Integrace do plně automatizovaných pracovních postupů a online QC systémů
• Využití pokročilých softwarových nástrojů pro detailní profilování nečistot
• Adaptace pro jiné biologické makromolekuly

Závěr

Vyvinutá Fast LC-HILIC/Q-TOF MS metoda bez iontově párovacích reagentů nabízí robustní, přesnou a vysoko-propustnou analýzu oligonukleotidů. Výsledky ukazují vynikající hmotnostní přesnost, kompletní sekvenční pokrytí a vysokou reprodukovatelnost při celkové době vzorek–report cca 5 minut.

Reference

1. Rye P.; Yang Y. Agilent Technologies Application Note 5994-3753EN, 2022
2. Rye P.; Schwarzer C. Agilent Technologies Application Note 5994-5631EN, 2023
3. Li G.; Rye P. Agilent Technologies Application Note 5994-5632EN, 2023
4. Wong D.; Rye P. Agilent Technologies Application Note 5994-4817EN, 2022
5. Wong D.; Rye P. Agilent Technologies Application Note 5994-5071EN, 2022