Structural Analysis of Native N-Glycans Released from Proteins Using a Novel Mixed-Mode Column and a Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Glykosylace proteinů ovlivňuje jejich strukturu, funkci i farmakokinetiku. Precizní analýza N-glykanů je kritická pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek a biosimilars. Rozlišení izomerů a korektní určení sialylace přispívá k pochopení biologické aktivity a imunogenicity glykoproteinů.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává dvě chromatografické strategie pro strukturální charakterizaci N-glykanů: analýzu nativních (nelabelovaných) versus 2AB označených glykánů. K separaci glykanů slouží nový typ mixovaně módní kolony GlycanPac AXH-1, kombinující slabou aniontovou výměnu a HILIC. Detekci a strukturální identifikaci provádí Q Exactive hybridní kvadrupól-Orbitrap MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy:

• Enzymatické uvolnění N-glykanů z glykoproteinů (PNGase F).
• Purifikace SPE sloupcem HyperSep Hypercarb.
• Příprava 2AB značeného vzorku (2AB, acetonitril).

Chromatografie:

• Kolona GlycanPac AXH-1 (2,1×150 mm, 1,9 µm).
• Mobilní fáze A: 80 % acetonitril/20 % voda; B: 80 mM amonný formiát (pH 4,4).
• Gradient 97,5 % A → 62,5 % A během 40 min, průtok 0,4 mL/min, 30 °C.

MS/MS podmínky:

• Režim ionizace: negativní ionizace.
• Rozsah m/z 380–2000, rozlišení 70 000 (MS), 17 500 (MS/MS), režim data-dependent HCD.

Software: ChromQuest 5.0, Xcalibur 2.2, SimGlycan pro identifikaci struktur.

Hlavní výsledky a diskuse

Kolona GlycanPac AXH-1 umožnila rozlišení nejprve neutrálních glykanů, poté mono- až pentasialylovaných druhů podle náboje. V rámci každé třídy byly separovány izomery na základě velikosti a polarity. MS/MS HCD fragmentace generovala glykozidické i cross-ring fragmenty, které SimGlycan přesně přiřadilo k databázovým strukturám.
Porovnání profilů nativních a 2AB značených vzorků odhalilo, že značení může vytvářet nežádoucí artefakty a posouvat sialylované glykovzorce do nižších nabitých forem. Analýza nativních glykánů tak zachovává původní profil a eliminuje časově náročné kroky značení.

Přínosy a praktické využití metody

Využití mixovaně módní kolony s kombinovanou aniontovou výměnou a HILIC umožňuje:

• Komplexní rozlišení ladiovaných i neladiovaných N-glykanových forem.
• Zvýšenou citlivost a selektivitu bez potřeby fluorescenčního značení.
• Rychlejší workflow díky vynechání kroků značení a následných čisticích metod.

Metoda je vhodná pro QC laboratoře v biotechnologickém průmyslu a pro vývoj nových bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace vysokorozlišovací MS s automatizovanými preparativními systémy a pokročilou bioinformatikou. Uplatnění naleznou datově náročné glykomické studie, multiplexní analýza glykookomplexů a AI-podpora při de novo charakterizaci neznámých glykanů. Přínosné bude i rozšíření databází glykanových izomerů a online sdílení výsledků.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace GlycanPac AXH-1 kolony a Q Exactive MS/MS nabízí robustní a vysoce selektivní přístup k analýze nativních N-glykanů bez potřeby značení. Metoda zlepšuje integritu dat a zkracuje dobu přípravy vzorku, což ocení zejména průmyslové a výzkumné laboratoře zabývající se glykoproteiny.

Reference

• [1] Varki A. Biological Roles of Oligosaccharides: All the Theories are Correct. Glycobiology 1993;3:97–130.
• [2] Bertozzi CR, Freeze HH, Varki A, Esko JD. Glycans in Biotechnology and the Pharmaceutical Industry. In: Essentials of Glycobiology. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009.
• [3] FDA Guidance for Industry: Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. 2012.
• [4] CarboPac PA200 data sheet. Dionex; 2006.
• [5] Hvizd MG et al. Simple Separation and Detection Techniques for the Analysis of Carbohydrates. Application Note LPN2954-01; 2011.
• [6] Apte A, Meitei NS. Bioinformatics in Glycomics: Glycan Characterization with Mass Spectrometric Data using SimGlycan software. Methods Mol Biol. 2010;600:269–281.