Label-Free Analysis by UHPLC with Charged Aerosol Detection of Glycans Separated by Charge, Size, and Isomeric Structure

Význam tématu

Glykanové struktury na glykoproteinech určují funkci, stabilitu a často slouží jako biomarkery onemocnění. Přímá kvantifikace nativních N-linked glykanů je klíčová pro výzkum, vývoj bioterapeutik a kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout rychlou a citlivou UHPLC metodu s detektorem nabitých aerosolů (CAD) pro přímé měření glykanového profilu glykoproteinů bez nutnosti chemické derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci glykanů byl použit systém Thermo Scientific Vanquish UHPLC vybaven Vanquish Charged Aerosol Detector H, GlycanPac AXR-1 mixed-mode kolonu (2.1 ×100 mm, 1.9 µm), Vanquish Binary Pump H, Split Sampler HT a Column Compartment H. Mobilní fáze A byla ultrapure voda, B 100 mM amonný formiát pH 4.4. Průtok činil 0.4 mL/min, teplota kolony 30 °C, objem injekce 2 µL. CAD parametry: teplota odpařovací trubice 50 °C, funkce výkonu 1.00, sběr dat 10 Hz, filtr 5 s.
Vzorky nativních N-glykanů se připravily enzymatickým uvolněním pomocí PNGase F a standardy sialylovaných glykanů pocházely z alditolového standardu fetuin.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizací gradientu (1 mM/min) a složení mobilní fáze (čistě vodný) byla dosažena vyvážená citlivost a robustnost metody. Vyšší biologické rozlišení zajistilo oddělení glykanů podle náboje (neutralní až tetrasialylované) a následné rozlišení izomerů reverzní fází. Kalibrační křivky pro mono-, di- a tri-sialylované glykanové standardy vykázaly koeficient determinace R2 > 0.995 a limity detekce nízkých pmol. Retence glykanů vykázala RSD < 0.1 %, plošná přesnost cca 2.8 %. Analýza proteinových digesátů potvrdila, že reakční vedleprodukty z PNGase F nepřekrývají glykanové špičky.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje univerzální, přímou a citlivou detekci nativních glykanů bez zdrojů derivatizace, což šetří čas a náklady. Výborně se hodí pro kontrolu kvality bioterapeutik, sledování stability glykosylovaných proteinů a výzkumné glykomické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti rozšíření zahrnují analýzu O-glykanů, multimodální hyphenace s hmotnostní spektrometrií, miniaturizaci na mikrofluidní platformy, plnou automatizaci workflow, integraci s bioinformatickými nástroji a multiplexní glykomické studie.

Závěr

UHPLC-CAD na GlycanPac AXR-1 představuje rychlou, citlivou a přesnou metodu pro přímou analýzu nativních N-linked glykanů bez nutné derivatizace, s vynikající linearitou, robustností a univerzálností detekce.

Reference

• Varki A. Biological Roles of Oligosaccharides: All of the Theories Are Correct. Glycobiology. 1993;3(2):97–130.
• Spencer D, Freeke J, Barattini V. A HILIC Method for the Analysis of Bovine Fetuin Glycans. Thermo Scientific Applications Note. 2013;2072.
• Hurum D, Basumallick L, Rohrer J. Evaluating protein glycosylation in limited-quantity samples by HPAE-PAD. Thermo Scientific Application Note. 2013;1050.
• Udayanath A, Saba J, Viner R, Liu X, Rao S, Agroskin Y, Huhmer A, Pohl C. Integrated LC/MS Workflow for the Analysis of Labeled and Native N-Glycans from Proteins Using a Novel Mixed-Mode Column and a Q Exactive Mass Spectrometer. Thermo Scientific Applications Note. 2014;595.
• Aich U, Saba J, Liu X, Thayer J, Pohl C. Separation of 2AB-labeled N-linked glycans from bovine fetuin on a novel ultra-high resolution mixed-mode column. Thermo Scientific Applications Note. 2014;20908.