Label-Free Profiling of O-linked Glycans by HPLC with Charged Aerosol Detection

Význam tématu

O-glykosylace patří mezi běžné posttranslační modifikace proteinů a ovlivňuje jejich biologické funkce. Profilování O-glykanů je klíčové pro kontrolu kvality biofarmaceutik, studium buněčných interakcí a vývoj diagnostických metod.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout kvantitativní, bezznačkovou metodu pro profilování O-glykanů uvolněných reduktivní β-eliminací. Použitý postup kombinuje UHPLC s detekcí nabitých aerosolů (CAD) a umožňuje přímou separaci a měření nativních glykanů kompatibilní s hmotovou spektrometrií.

Použitá metodika a instrumentace

Popis postupu:

• Reduktivní β-eliminace O-glykanů z glykoproteinů (fetuin, mucin, IgG) za použití NaBH4 v 0,1 M NaOH při 45 °C po dobu 18–24 h.
• Desalting a očista vzorků přes AG50W-X8 pryskyřici a 10 kDa spin-filtry, sušení ve SpeedVac a rekonstituce ve vodě.
• Separace na mixed mode kolóně GlycanPac AXH-1 (aniontová výměna + HILIC) při 30 °C a průtoku 0,5 mL/min.
• Detekce nativních O-glykanů bez značení pomocí Vanquish Charged Aerosol Detector (CAD) s nastavením aerosolu a korónového nabíjení.
• Zpracování chromatografických dat v softwaru Chromeleon CDS 7.2.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific Vanquish UHPLC
• Vanquish Charged Aerosol Detector H
• GlycanPac AXH-1, 2,1 × 100 mm, 1,9 μm
• Thermo Scientific Dionex Chromeleon CDS 7.2

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala citlivost na nízkých ng úrovních na kolonu a lineární dynamický rozsah přes dva řády. Přesnost ploch píků dosáhla v průměru 3 % RSD a retenční časy < 0,1 % RSD. O-glykany uvolněné z fetuinu, mucinu a IgG byly detailně rozlišeny podle stupně sialylace a polarity. Zbytkové produkty reakce nezasahují do detekce, což eliminuje nutnost složitého čištění.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduchá a rychlá příprava vzorku bez derivatizace.
• Univerzální detekce nativních glykanů bez potřeby fluoroforů či chromoforů.
• Kompatibilita s MS umožňuje následnou strukturální identifikaci.
• Robustní a opakovatelná metoda vhodná pro rutinní QC bioproduktů.
• Kvantifikace na základě jednotné odezvy CAD bez specifických standardů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Detailní ověření LOD, LOQ a linearity s autentickými O-glykanovými standardy.
• Optimalizace workflow a automatizace kroků uvolnění a čištění glykanů.
• Integrace CAD s hmotovou spektrometrií pro simultánní kvantifikaci a identifikaci.
• Rozšíření aplikace v klinickém výzkumu a vývoji nových bioterapeutik.

Závěr

Label-free UHPLC-CAD protokol poskytuje citlivou, přesnou a efektivní analýzu nativních O-glykanů bez složitých derivatizačních kroků, což jej činí ideálním pro akademické i průmyslové aplikace.

Reference

1. Carlson D. J. Biol. Chem. 1966, 241, 2984–2986.
2. Thomas D.; Acworth I. Label-Free Analysis by UHPLC with Charged Aerosol Detection of Glycans Separated by Charge, Size, and Isomeric Structure. Thermo Scientific Appl. Note 1127, 2015.
3. Hurum D.; Basumallick L.; Rohrer J. Evaluating protein glycosylation in limited-quantity samples by HPAE-PAD. Thermo Scientific Appl. Note 1050, 2013.
4. Spencer D.; Freeke J.; Barattini V. A HILIC Method for the Analysis of Bovine Fetuin Glycans. Thermo Scientific Appl. Note 2072, 2013.
5. Hanneman A. J. S.; Rouse J. C. Profiling and Characterization of N- and O-linked Glycans Released from Glycoproteins using RP-HPLC with Charged Aerosol Detection and Mass Spectrometry. Poster ASMS 2009.
6. Hanneman A. J. S.; Ashline D. J.; Zhang H.; Reinhold V. N. LC-MS Profiling and Characterization of Biopharmaceutical O-glycans: Comparison of Reductive and Nonreductive Release Paired with CAD or UV Detection. CASSS 2013.