Label-Free Analysis by HPLC with Charged Aerosol Detection of Glycans Separated by Charge, Size and Isomeric Structure

Význam tématu

N-glykanové struktury u glykoproteinů hrají klíčovou roli v jejich biologické aktivitě a mohou sloužit jako biomarkery onemocnění nebo ovlivňovat účinnost bioterapeutik. Precizní a rychlá analýza glykanového profilu je proto zásadní pro výzkum i rutinní kontrolu kvality biopharmaceutik.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout jednoduchou a rychlou metodu kvantitativního profilování N-glykanů bez nutnosti chemického značení. Metoda kombinuje enzymatické uvolnění glykanů (PNGase-F) s mixed-mode UHPLC separací a přímou detekcí nabitými aerosolovými částicemi (CAD), přičemž je zachována kompatibilita s hmotovou spektrometrií pro další šetrnou charakterizaci.

Použitá metodika a instrumentace

UHPLC separace:

• Zařízení: Thermo Scientific Vanquish UHPLC s Charged Aerosol Detector H
• Kolóna: GlycanPac AXR-1 (1,9 µm, 2,1 × 100 mm), teplota 30 °C
• Mobilní fáze A: voda; B: 100 mM amonný formiát pH 4,4; průtok 0,4 mL/min; gradient 4→39 % B (1 mM/min)
• Injekce 2 µL; odpařovací teplota CAD 50 °C; datová frekvence 10 Hz; filtr 5 s

Enzymatická příprava:

• PNGase-F digest s QA-Bio deglykozylací sadou
• Denaturace 100 °C, inkubace 18 h při 37 °C
• Odsátí supernatantu a přímá injekce do UHPLC

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální gradientní sklon 1 mM/min poskytuje nejlepší rozlišení
• Zařazení 5 % organického rozpouštědla mírně zlepšilo S/N, nebylo však nezbytné
• Evaporační teplota 50 °C je kompromisem mezi citlivostí a stabilitou signálu
• Detekční limity pod 10 ng/µL (0,6–8,8 pmol/µL); dynamický rozsah > 100×
• Retenční časy RSD < 0,1 %; plocha špiček RSD < 3 %
• Přímá detekce glykanů z fetuinu a alfa-kyselého glykoproteinu bez interference reagencií

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace časově náročného značení šetří náklady i čas
• Vysoká citlivost a linearita vyhovují potřebám QC laboratoří
• Kompatibilita s MS umožňuje multifázovou analýzu ze stejného vzorku
• Univerzální detekční princip pro všechny nevolatilní analyty

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace UHPLC-CAD s high-resolution MS pro detailní strukturální analýzu
• Automatizace vzorkování a vysokopropustné platformy pro vysoce efektivní screening
• Rozšíření aplikací na široké spektrum glykoproteinů v biomedicíně a regulované výrobě
• Využití strojového učení pro rychlé vyhodnocování glykanových profilů

Závěr

Vyvinutá label-free UHPLC-CAD metoda je robustní, přesná a rychlá. Nabízí uniformní odezvu, vysokou citlivost a přesnost retence i plochy špiček, ideální pro QC bioterapeutik i výzkumné účely. Eliminace derivatizace zjednodušuje workflow a zachovává kompatibilitu s dalšími analytickými technikami.

Reference

1. Varki A Biological Roles of Oligosaccharides All of the Theories Are Correct Glycobiology 1993 3 97-130
2. Spencer D Freeke J Barattini V A HILIC Method for the Analysis of Bovine Fetuin Glycans Thermo Scientific Application Note 2072 2013
3. Hurum D Basumallick L Rohrer J Evaluating protein glycosylation in limited-quantity samples by HPAE-PAD Thermo Scientific Application Note 1050 2013
4. Udayanath A Saba J Viner R Liu X Rao S Agroskin Y Huhmer A Pohl C Integrated LC/MS Workflow for the Analysis of Labeled and Native N-Glycans from Proteins Using a Novel Mixed-Mode Column and a Q Exactive Mass Spectrometer Thermo Scientific Application Note 595 2014
5. Aich U Saba J Liu X Thayer J Pohl C Separation of 2AB-labeled N-linked glycans from bovine fetuin on a novel ultra-high resolution mixed-mode column Thermo Scientific Application Note 20908 2014