Quantification of peptides in MS-based proteomics

Význam tématu

Stanovení koncentrace peptidů před jejich vstřikováním do LC-MS/MS systému je klíčové pro dosažení spolehlivých a reprodukovatelných výsledků v proteomice. Přesné dávkování optimalizuje identifikaci peptidů a proteinů, minimalizuje plýtvání vzorkem a zkracuje dobu analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace MS peptide quant na systémech Lunatic je rychlá a bezprostřední kvantifikace komplexních peptidových směsí pomocí UV/Vis spektroskopie a výpočet doporučeného objemu vstřikované vzorku. V případě uvedeného příkladu byla prováděna séria ředění K-562 proteomického digestu s cílem určit optimální množství peptidů pro následnou LC-MS/MS analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

• Spektroskopie UV/Vis při 280 nm s E1% = 10 a korekcí na pozadí turbidity profile.
• Softwarová aplikace MS peptide quant na Lunatic a Little Lunatic: výpočet koncentrace (μg/μL) a požadovaného injekčního objemu (μL).
• LC separace na nano-LC column (40 cm, 1.9 μm C18) s gradientem acetonitrilu přes 140 min.
• MS detekce na Q Exactive HF (Thermo) spojeném s Ultimate 3000 RSLCnano System.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální identifikace peptidů byla dosažena při vstřiku 3–6 μg peptidů, přičemž vrchol nastal na 3 μg.
• Snížení průměrné doby injekce MS2 signálů a maximální plocha chromatografických peaků potvrzují vhodné zatížení kolony i MS.
• Při nižších dávkách (<1 μg) je identifikováno méně peptidů, při vyšších (>6 μg) dochází k útlumu signálu i poklesu identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a bezobslužná kvantifikace peptidových směsí bez nutnosti chromatografického kroku.
• Optimalizace vstřikovaného množství zvyšuje pokrytí proteomu a efektivitu analýzy.
• Jednoduché reportování ve vícero formátech (HTML, CSV, XLSX, PDF) pro rychlé nasazení v QA/QC a výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s automatizovanými pracovními stanovišti a robotickými platformami pro vysokopropustné analýzy.
• Pokročilé algoritmy a strojové učení pro predikci optimálního zatížení podle charakteru vzorku.
• Rozšíření metody na jiné biomolekuly (oligonukleotidy, metabolity) a miniaturizace měřící platformy.

Závěr

MS peptide quant aplikace na systémech Lunatic výrazně zjednodušuje a zrychluje stanovení peptidové koncentrace a doporučeného objemu vstřiku do LC-MS/MS. Případová studie prokázala, že optimální dávka 3 μg peptidů maximalizuje počet identifikací a zlepšuje kvalitu dat.

Reference

• Unchained Labs Application Note Quantification of peptides in MS-based proteomics Rev A 2020