Quantification of total nucleic acids from unknown sources (RNA eq)

Význam tématu

Stanovení celkových nukleových kyselin ve vzorcích neznámého původu je klíčové pro řadu aplikací v molekulární biologii, biotechnologii a QC v potravinářském či farmaceutickém průmyslu. Přesná kvantifikace RNA ekvivalentu umožňuje spolehlivé vyhodnocení kvality extraktů z bakterií, kvasinek, rostlin či plasmidové DNA a poskytuje základ pro další analýzy, jako je RT-qPCR nebo sekvenování.

Cíle a přehled studie / článku

Tento aplikační poznámka popisuje využití Unmix aplikace „Nucleic Acids (RNA equiv.)“ na systémech Lunatic a Little Lunatic od společnosti Unchained Labs. Cílem je demonstrovat postup spektrofotometrické dekonvoluce UV/Vis spektra vzorku za účelem izolace signálu nukleových kyselin od rušivých absorpčních komponent a stanovit koncentraci nukleových kyselin přepočtenou na RNA ekvivalent.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byla použita následující instrumentace:

• Lunatic system (Unchained Labs) se softwarovou aplikací Unmix – možnost plné konfigurace výstupních reportů (HTML, XML, TXT, CSV, XLSX, PDF).
• Little Lunatic (Unchained Labs) s předdefinovanými šablonami reportu (HTML, TXT, CSV).
• Překližka (mikrovolumetrická kyveta) a čistá voda jako blank.

Metoda spočívá v měření UV/Vis spektra vzorku a následné matematické dekonvoluci komponent:

• Profil nukleových kyselin – spektrem specifickým pro RNA, degradovanou RNA či DNA s různým GC obsahem; koncentrace se počítá jako A260 × 40 (RNA ekvivalent).
• Profil nečistot – absorpce jiných molekul v oblasti UV; vyhodnocuje se v OD260 s možností detailního hlášení fenolu, tiokyanátů, bufferových složek, detergentů a proteinu.
• Profil pozadí – absorpce způsobená turbidity (částice, hem, chlorofyl); odečítá se od měřeného spektra.
• Parametr kvality fitu (RRSE) – relativní reziduální chyba ve spektru, indikující podíl nevysvětlené absorpce, s výstrahou při hodnotách nad 2,5 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Aplikace Unmix umožnila spolehlivou separaci a kvantifikaci nukleových kyselin ve všech testovaných vzorcích neznámého původu. Systémy automaticky vyhodnotily:

• Koncentraci nukleových kyselin v ng/µl RNA ekvivalentu.
• Úroveň nečistot dle předem definovaných práhů (fenol 0,086 mM; tiokyanáty 0,1525 mM; protein 0,1 OD280 aj.).
• Úroveň pozadí (částice 0,5 OD260; hem 0,05 OD260; chlorofyl 0,1 OD260).
• Parametr kvality fitu s upozorněním na vysokou turbidity nebo přítomnost neznámých absorbujících látek.

Diskuse se zaměřuje na robustnost dekonvolučního algoritmu při různých typech vzorků a jeho schopnost odlišit cílovou molekulu od spektrálních interferencí.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace Unmix aplikace přináší:

• Rychlou a bezodpadovou spektrofotometrickou kvantifikaci nukleových kyselin s minimem přípravných kroků.
• Automatické hlášení relevantních nečistot a kvality extraktu bez nutnosti ruční interpretace spekter.
• Univerzální použití pro široké spektrum biologických vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciál dalšího rozvoje spočívá v rozsáhlejší automatizaci pracovních postupů, integraci s robotickými pipetovacími stanicemi a vylepšení spektrálních knihoven pro identifikaci širšího spektra rušivých látek. Použití strojového učení by mohlo zvýšit přesnost dekonvoluce ve složitých nebo nízkokoncentrovaných vzorcích.

Závěr

Unmix aplikace na platformách Lunatic a Little Lunatic nabízí spolehlivou, rychlou a vysoce přesnou metodu pro stanovení celkových nukleových kyselin v RNA ekvivalentech z neznámých vzorků. Díky automatizovanému vyhodnocení nečistot a pozadí metoda výrazně zjednodušuje QC procesy v moderních laboratořích.

Reference

• Žádné další literární zdroje nebyly uvedeny.