Quantification of purified PCR samples

Význam tématu

Precizní stanovení koncentrace purifikovaných PCR produktů je zásadní pro zajištění reprodukovatelnosti, kvality a efektivity následných molekulárně biologických postupů. Metoda UV/Vis spektroskopické dekonvoluce umožňuje oddělit signál cílové amplicony od koabsorbujících příměsí, což výrazně zvyšuje spolehlivost měření bez nutnosti použití barviv či dalších značení.

Cíle a přehled studie

Tato Application Note představuje aplikaci Purified PCR založenou na Unmix algoritmu pro systémy Lunatic a Little Lunatic. Cílem je ukázat, jak pomocí analýzy tvaru UV/Vis spektra izolovat a kvantifikovat DNA amplicon po purifikaci různými metodami či komerčními sadami.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda spočívá v měření UV/Vis absorpčního spektra vzorku a následné spektroskopické dekonvoluci do tří hlavních komponent:

• Amplicon – DNA cílová molekula, concentrační výpočet na základě A260 a faktoru 50 pro dsDNA.
• Příměsi – ne-DNA látky (dNTP, guanidin-thiocyanát, EDTA, leachables, betain).
• Pozadí – zákal vzorku včetně zbytkových nosičových kuliček.

Instrumentace:

• Lunatic – plně vybavený Unmix systém s flexibilní generací reportů (HTML, XML, TXT, CSV, XLSX, PDF).
• Little Lunatic – kompaktní verze s pevně danými šablonami reportů (HTML, XML, TXT, CSV).
• Vždy použití čiré vody jako blanku pro korekci pozadí.

Hlavní výsledky a diskuse

Unmix aplikace úspěšně rozlišila signál ampliconu, nečistot a pozadí. Kvalita fitu je hodnocena pomocí reziduálního procenta (RRSE); vzorky s hodnotou nad 2,5 % jsou označeny varováním. Při nízké koncentraci DNA (<0,5 OD při 260 nm) nebo přítomnosti neznámých sloučenin se zobrazí souhrnná křivka celkových nukleových kyselin. Porovnání výsledků s komerční fluorescenční sadou a klasickou A260 metodou prokázalo podobné hodnoty kvantifikace; rozdíly u fluorescenčních metod pro fragmenty <1000 bp lze přičíst závislosti kalibrace na délce fragmentu.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizované a objektivní stanovení koncentrace bez použití exogenních barviv.
• Okamžitá analýza během několika sekund bez uživatelského zásahu.
• Integrovaná diagnostika kvality fitu a detekce nechtěných látek.
• Flexibilní formáty exportu dat vhodné pro LIMS a další systémy kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace strojového učení pro vylepšenou dekonstrukci spekter a predikci neznámých sloučenin.
• Rozšíření aplikace na kvantifikaci jiné nukleové kyseliny či detekci modifikací.
• Vývoj miniaturizovaných a přenosných zařízení pro polní či klinické použití.
• Real-time sledování výkonu purifikačních procesů přímo v laboratoři.

Závěr

Unmix aplikace Purified PCR na systémech Lunatic nabízí rychlou, přesnou a uživatelsky příjemnou metodu kvantifikace purifikovaných PCR produktů. Díky oddělení signálu DNA a příměsí zajišťuje konzistentní výsledky a podporuje efektivitu laboratorních workflow.

Reference

• Choppee Bortz P.D., Wamhoff B.R. (2011) PLoS ONE 6(10): e26015.