Quantification of total protein content

Význam tématu

Proteinová kvantifikace představuje klíčový krok při analýze biologických vzorků, zejména v případech, kdy je nutné přesně stanovit koncentraci proteinu v přítomnosti rušivých složek, jako jsou nukleové kyseliny, detergenty nebo fragmenty buněčných struktur. Spolehlivé údaje jsou nezbytné pro výzkum, kontrolu kvality a optimalizaci biochemických procesů.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané procedury je demonstrovat využití aplikace Protein (Lysates) v systémech Lunatic a Little Lunatic pro přesné stanovení celkového obsahu proteinu. Metoda vychází z analýzy UV/Vis spektrálních dat a jejich dekonvoluce na tři složky: protein, neproteinové nečistoty a pozadí vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Princip metody spočívá ve spektrálním "unmixingu" měřeného UV/Vis záznamu. Spektrum je rozloženo na:

• Profil proteinu – koncentrace vypočtená na základě absorbance při 280 nm a definovaného E1 % koeficientu (výchozí hodnota 10).
• Impurity – spektrální složky pocházející z nukleových kyselin, azidu, inhibitorů proteáz, polysacharidů či detergentů.
• Pozadí – zohledňuje zákal vzorku, který je automaticky odečten před vyhodnocením obsahu.

Instrumentace zahrnuje:

• Systém Lunatic a jeho kompaktnější verzi Little Lunatic.
• Software Unmix Application (Protein Lysates), kde uživatel zadá typ vzorku a volitelně upraví E1 %.
• Použití deionizované vody jako blanku pro kalibraci.

Hlavní výsledky a diskuse

Aplikace rozpozná tři komponenty a graficky je odliší barvami (zelená protein, modrá impurity, šedá pozadí). Pro hodnocení kvality dekonvoluce slouží hodnota RRSE (Residue or Quality of Fit); překročení 5 % indikuje příliš vysoký zákal, přítomnost neznámé látky nebo nízkou koncentraci. Výsledky jsou okamžitě zobrazeny na obrazovce a lze je exportovat do HTML, XML, TXT, CSV, XLSX a PDF (Lunatic), resp. do předdefinovaných formátů TXT, CSV (Little Lunatic).
Tabulka kompatibility ukazuje, že běžné detergenty (Tween 80, Tween 20, Triton X-100, NP-40, SDS, CHAPS) neovlivňují měření do stanovených maximálních koncentrací (například 0,01 % pro Triton X-100 a NP-40, 0,5 % pro SDS, až 20 % pro CHAPS).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje rychlou, automatizovanou a přesnou kvantifikaci proteinu i v komplikovaných matricích bez nutnosti předchozí separace. Umožňuje šetřit čas a reagencie, zavádět rutinní kontrolní postupy v biotechnologických i farmaceutických provozech a zajišťuje reprodukovatelné výsledky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry rozvoje mohou být:

• Integrace do vysoce propustných (high-throughput) automatizovaných platforem.
• Rozšíření spektrální knihovny o další biomolekuly.
• Využití strojového učení pro vylepšenou dekonvoluci a detekci neznámých složek.
• Miniaturizace a cloudová správa výsledků pro vzdálený přístup a sdílení dat.

Závěr

Popsaný postup založený na Unmix aplikaci v systémech Lunatic umožňuje efektivní dekonvoluci UV/Vis spekter a přesnou kvantifikaci proteinu v přítomnosti rušivých látek. Díky jednoduchému ovládání, automatizovanému hodnocení kvality a široké kompatibilitě je metoda vhodná pro rutinní analýzy i pokročilý výzkum.

Reference

Unchained Labs. Quantification of total protein content. Application Note Rev E, 2020.