A Xevo™ G3-based Workflow for Purity Determination, Intact Mass Measurement, and MS/MS Sequencing of Impurities Detected in Synthetic Oligonucleotides

Význam tématu

Charakterizace syntetických oligonukleotidů a jejich nízkoúrovňových nečistot je klíčová pro bezpečnost a účinnost oligonukleotidových terapeutik. Pokročilé analytické metody umožňují detailní určení hmotnosti a sekvence plné délky produktu i vedlejších produktů syntézy, což je nezbytné při vývoji, výrobě a kontrole kvality v regulovaných i neregulovaných laboratořích.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat, jak integrované workflow založené na UPLC-QTof-MS se softwarem waters_connect usnadňuje:

• určení čistoty syntetických oligonukleotidů,
• měření intaktní hmotnosti plné délky produktu,
• MS/MS sekvenování nečistot pro potvrzení jejich identity.

Studie využívá systém Xevo G3 QTof spojený s ACQUITY Premier UPLC a aplikacemi INTACT Mass a CONFIRM Sequence pro automatizované zpracování dat.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická metoda:

• Chromatografie: ion-pair reverzní fáze na kolóně ACQUITY Premier OST C18 (1,7 µm, 2,1×150 mm) při 60 °C a 300 µl/min.
• Mobilní fáze: voda s 7 mM TEA a 40 mM HFIP (A) a 50 % methanol s 3,5 mM TEA a 20 mM HFIP (B).
• Gradient: postupný nárůst podílu B dle optimalizovaného programu.

MS podmínky:

• Systém: Xevo G3 QTof, ESI v negativním módu.
• Rozsah m/z 400–2000, nahrávání MSE a cílené MS/MS.
• Kolizní energie: nízká 6 V, vysoká rampy 15–45 V; cílené CE 40–45 V podle předkurzoru.

Informatika:

• Platforma waters_connect verze 3.6.0.21.
• INTACT Mass App verze 1.8.0.10 pro bayesovskou dekonvoluci a automatické přiřazení monoisotopické neutralní hmotnosti.
• CONFIRM Sequence App verze 1.4.0.13 pro automatizovanou anotaci frakčních iontů a zobrazení pokrytí sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie se systémem ACQUITY Premier díky povrchové technologii High Performance Surfaces umožnila rozlišení šestnácti nečistot siRNA 21-mer, včetně stopových úrovní 0,05 % FLP podle UV detekce.
MS přístroj Xevo G3 prokázal vysokou citlivost přenosu i pro nízkoabundantní předkurzory a zajišťoval kvalitní CID fragmentaci.
INTACT Mass App automaticky dekonvolvoval spektra a přiřazoval nečistoty s chybnou odchylkou pod 10 ppm.
CONFIRM Sequence App dosáhl 100% pokrytí sekvence plné délky produktu a přes 80% pokrytí i pro nejnižší nečistoty (např. 6-mer s 5′ fosforylací), čímž potvrdil jejich struktury.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí:

• plnou automatizaci zpracování LC-MS dat,
• rychlou identifikaci a potvrzení nečistot bez ruční interpretace,
• vysokou robustnost a reprodukovatelnost v regulovaném prostředí,
• podporu jak vývojových, tak rutinních kontrolních laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření na různé třídy oligonukleotidů a modifikací, zlepšení integrace s GMP prostředím a pokročilá datová analýza využívající strojové učení pro rychlejší a detailnější profilování nečistot.

Závěr

Integrované UPLC-QTof-MS řešení se softwarem waters_connect nabízí spolehlivou platformu pro komplexní charakterizaci syntetických oligonukleotidů. Synergie intaktního měření hmotnosti a MS/MS sekvenování umožňuje citlivé odhalení i potvrzení nízkoúrovňových nečistot, čímž podporuje vývoj a kontrolu kvality moderních oligonukleotidových terapeutik.

Reference

1. Sharma VK, Watts JK. Oligonucleotide therapeutics: chemistry, delivery and clinical progress. Future Med Chem. 2015;7(16):2221–2242.
2. Roberts TK, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19:673–694.
3. Doneanu CE et al. Automated compliance-ready LC-MS workflow for intact mass confirmation and purity analysis of oligonucleotides. Waters appl note 720006820, 2020.
4. Doneanu CE et al. Analysis of oligonucleotide impurities on the BioAccord system with ACQUITY Premier. Waters appl note 720007301, 2021.
5. Doneanu CE et al. LC-MS analysis of siRNA, sgRNA and impurities using the BioAccord system with ACQUITY Premier and INTACT Mass. Waters appl note 720007546, 2022.
6. Doneanu CE et al. CONFIRM Sequence: waters_connect application for sequencing of synthetic oligonucleotides and their impurities. Waters appl note 720007677, 2022.
7. DeLano M et al. Using hybrid organic-inorganic surface technology to mitigate analyte interactions with metal surfaces in UHPLC. Anal Chem. 2021;93:5773–5781.
8. Gilar M, DeLano M, Gritti F. Mitigation of analyte loss on metal surfaces in liquid chromatography. J Chrom A. 2021;1650:5773–5781.