Robust, rapid SEC-MALS titer analysis of AAV particles using 3 μm, 550 Å monodisperse SEC media in bioinert column hardware

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují důležitý nástroj genové terapie pro dlouhodobou expresi terapeutických proteinů. Přesné stanovení titru virových částic a podíl agregátů je kritické pro kvalitu vektorů, bezpečnost pacientů a validaci výrobních procesů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit robustnost, přesnost a rychlost kvantifikace AAV5 monomerů a agregátů pomocí SEC-MALS metody v kombinaci s novými 3 µm, 550 Å monodisperzními kolónami SurePac Bio 550 SEC MDi. Studie porovnává výkon zkrácené 150 mm kolóny s tradiční 300 mm kolónou od jiného dodavatele při různých provozních podmínkách a mezi analytiky.

Použitá metodika

• Rozdělení částic podle hydrodynamického objemu pomocí size exclusion chromatography (SEC).
• Současná detekce molekulové hmotnosti a titru pomocí multi-angle light scattering (MALS).
• Vyhodnocení přesnosti: opakované měření AAV5 (n=2), třídenní opakování (n=3 dnů) a mezianalytická srovnání.
• Porovnání monodisperzních 3 µm částic s polydisperzními 5 µm částicemi a konvenční 300 mm kolónou.
• Použití BSA jako standardu pro sledování stability a opakovatelnosti.

Použitá instrumentace

• Kolóna Thermo Scientific SurePac Bio 550 SEC MDi 3 µm, 4,6×150 mm
• Konvenční SEC kolóna 5 µm, 500 Å, 4,6×300 mm
• SEC-MALS systém s optikou Wyatt Technology ASTRA 8.1.2
• Mobilní fáze: 350 mM NaCl, 0,001 % PF-68, pH 7,4 DPBS
• Provozní podmínky: průtok 0,3 mL/min, teplota 25 °C, objem injekce 20–40 µL

Hlavní výsledky a diskuse

• Opakovatelnost a mezi­denní přesnost dosáhly %CV ≤ 20 % pro molekulovou hmotnost, hydrodynamický poloměr i titr (celkový, plný, prázdný).
• SurePac kolóna dosáhla dvojnásobného počtu plat platí oproti 300 mm kolóně, což reflektuje lepší separační účinnost.
• Analýza se zpřesněním agregátů (dimer, trimer, tetramer) detekovala i slabě zastoupené formy díky vyššímu rozlišení (dimer: 1,72 vs. 1,26).
• Doba analýzy a spotřeba vzorku se zkrátily o více než 50 % ve srovnání s delší konvenční kolónou.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a přesný monitoring titru a agregací během vývoje a výroby genových vektorů.
• Úspora vzorku i mobilní fáze vede k efektivnějšímu provozu QC laboratoří.
• Lepší reprodukovatelnost mezi šaržemi a analytiky posiluje validaci metod pro GMP prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další virové vektory a nanočástice.
• Integrace s automatizovanými vysokopropustnými platformami pro screening stability.
• Kombinace s dalšími detektory (UV, RI) pro komplexní charakterizaci biopolymérů.

Závěr

Studie prokázala, že SEC-MALS v kombinaci s 3 µm monodisperzními SurePac Bio 550 SEC MDi kolónami nabízí robustní, rychlý a vysoce přesný způsob kvantifikace AAV částic a jejich agregátů. Výrazné zrychlení analýzy, nižší spotřeba vzorku a vyšší separační účinnost představují významnou přidanou hodnotu pro vývoj a kontrolu kvality genových terapií.