Size-exclusion chromatography of adeno-associated viruses with the SurePac Bio 550 SEC MDi column

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují klíčové vektory v genové terapii díky své nízké imunogenicitě, bezpečnosti a dlouhodobé exprimaci terapeutických genů. Vysoce čisté a homogenní přípravy AAV jsou zásadní pro dosažení konzistentních klinických výsledků a minimalizaci nežádoucích imunitních reakcí. Velmi důležité je proto rychlé a spolehlivé oddělení monomerických částic od agregátů a detekce případných nečistot.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo demonstrovat schopnost kolony SurePac Bio 550 SEC MDi (3 µm monodisperzní křemičité částice, pórovitost 550 Å) zajistit baseline separaci AAV monomerů a vysokomolekulárních formací (HMWS) během pouhých 4 minut. Studie zahrnuje:

• Porovnání detekčních režimů UV (260 a 280 nm) a fluorescence
• Vliv různých průtoků (0,05–0,6 mL/min) na rozlišení
• Dopad objemu vzorku až do 50 µL na šířku a plochu piku
• Komparaci s konkurenčními kolónami (2,5 µm/450 Å a 5 µm/500 Å)
• Posouzení opakovatelnosti výkonu mezi rozdílnými výrobními šaržemi kolony

Použitá instrumentace

Pro běžné SEC analýzy bylo využito UHPLC vybavení:

• Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary UHPLC (pumpa, odběrač, termostat
• Detektory: Vanquish VWD (260/280 nm) a Vanquish Fluorescence (Ex 280/Em 330 nm)
• Eppendorf ThermoMixer F1.5 pro přípravu vzorků

Pro SEC-MALS doplňující měření:

• UltiMate LPG-3400RS pumpa, WPS-3000TBRS autosampler, TCC-3000RS kolona-kompartment
• Vanquish Diode Array Detector
• Wyatt Optilab refraktometr a DAWN MALS detektor

Použitá metodika

Kolona: SurePac Bio 550 SEC MDi 4,6 × 150 mm, 3 µm, 550 Å
Mobilní fáze: 50 mM fosfátový pufr + 300 mM NaCl, pH 6,5
Průtok: 0,3 mL/min, teplota 30 °C, doba běhu 10 min
Injekční objem: UV 1 µL, FLD 0,2–0,4 µL (v závislosti na serotypu)
Vzorky: AAV serotypy 3, 5, 8, 9 (2 × 10^13 vg/mL), 10× zředění v PBS pro variabilní objemy (4–50 µL)

Hlavní výsledky a diskuse

UV a fluorescence společně umožnily jednoznačnou identifikaci píků (280 nm – proteiny; 260 nm – nukleové kyseliny). Ve čtyřech testovaných serotypech byla monomer-HMWS baseline separace zachována i při krátké analýze pod 4 minuty. SEC-MALS měření potvrdila správný titer, kvantifikaci agregátů a molekulovou hmotnost píků s lepším rozlišením dimeru (R=1,72 vs. 1,26) ve srovnání s konkurenční kolónou. Experimentální změna průtoku ukázala, že pomalé rychlosti (0,05 mL/min) maximalizují rozlišení (R=4,7), zatímco vyšší (0,6 mL/min) umožňují vysokou propustnost za cenu mírného snížení rozlišení (R~2,2). Zvýšení vstupního objemu až na 50 µL způsobilo pouze ~26% nárůst šířky piku na polovině výšky, aniž by se snížila kvalita separace. Komparativní test s kolónou 2,5 µm/450 Å prokázal významné snížení doby analýzy a nižší zpětný tlak (~200 psi) při zachování vysoké ostrosti píků. Různé výrobní šarže SurePac Bio MDi ukázaly téměř shodné chromatogramy, což potvrzuje excelentní lot-to-lot reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda dovoluje:

• Rychlou QC analýzu AAV monomerů a agregátů v bioprodukci
• Snížení množství vzorku díky fluorescenční detekci
• Integraci se SEC-MALS pro komplexní charakterizaci titeru a molekulové hmotnosti
• Opakovatelná data mezi kolónami a šaržemi

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Automatizace a vysokopropustné formáty pro screening v reálném čase
• Rozšíření použití na jiné viralní vektory a nanočástice
• Integrace se spektrálními detektory a hmotnostní spektrometrií
• Optimalizace mAb SEC pro vlastní povrchové úpravy stacionární fáze

Závěr

SurePac Bio 550 SEC MDi kolona (3 µm, 550 Å) prokázala výjimečnou schopnost rychlé a spolehlivé separace AAV monomerů od agregátů s vysokým rozlišením a nízkým zpětným tlakem. Metoda je vhodná pro rutinní QC a výzkumné aplikace v biopharmaceutickém průmyslu.

Reference

1. Rittié L., Athanasopoulos T., Calero-Garcia M., Davies M.L., Dow D.J., Howe S.J., Morrison A., Ricciardelli I., Saudemont A., Jespers L., Clay T.M. The Landscape of Early Clinical Gene Therapies outside of Oncology. Molecular Therapy. 2019;27(10):1706–1717.
2. Tustian A.D., Bak H. Assessment of Quality Attributes for Adeno-associated Viral Vectors. Biotechnology & Bioengineering. 2021;118(11):4168–4203.
3. Khatwani S.L., Pavlova A., Pirot Z. Anion-exchange HPLC assay for separation and quantification of empty and full capsid in multiple adeno-associated virus serotypes. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 2021;21:548–558.