Achieving consistent SEC performance through the use of 3 μm, 550 Å monodisperse media in novel bioinert column hardware

Význam tématu

SEC (velikostní vylučovací chromatografie) umožňuje oddělení a kvantifikaci proteinových agregátů na základě jejich hydrodynamického objemu. Konzistentní a reprodukovatelná separace je nezbytná pro výzkum a výrobu biologických léčiv, zejména adeno-asociovaných virů (AAV), kde se sleduje poměr monomerů k agregátům.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat výhody nového bioinertního povlaku a 3 µm monodisperzního média s 550 Å póry v SEC kolónách SurePac Bio 550 SEC MDi a prokázat vynikající konzistenci výsledků mezi šaržemi a mezi jednotlivými kolónami.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Technika: SEC s UV detekcí (280 nm) a refraktometrickou (RI) detekcí pro analýzu PEG/PEO.
• Mobilní fáze: 50 mM fosfátový pufr se 300 mM NaCl, pH 6,5, izokratický režim.
• Provozní podmínky: teplota 30 °C, průtok 0,35 mL/min, injekční objem 1–20 µL.

Použitá instrumentace:

• Kolony: Thermo Scientific SurePac Bio 550 SEC MDi 3 µm (4,6 × 150 mm) a vývojový prototyp v konvenčním nerezovém hardware.
• Software: Thermo Scientific Chromeleon 7.3.2 CDS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Bioinertní povlak významně omezuje sekundární interakce vzorku s povrchem hardware a umožňuje téměř 100% regeneraci vzorku již při první injekci.
• Monodisperzní částice zajišťují úzké rozdělení velikosti a vynikající reprodukovatelnost mezi šaržemi (minimální variabilita retenčních časů).
• Optimální průtok 0,35 mL/min (reduced plate height ~2,1 cm/min) představuje kompromis mezi rychlostí analýzy a vysokým rozlišením (hodnoceno na thyroglobulinovém dimeru).
• Kalibrace byla provedena na proteinech (4-aminobenzoová kyselina, albumin, thyroglobulin) i na polymerních vzorcích PEG/PEO; závislost eluce na logaritmu molekulové hmotnosti či hydrodynamického poloměru vykazuje lineární vztah s R² > 0,93.
• Rozsah účinné separace odpovídá hydrodynamickým poloměrům 4–30 nm, což je vhodné pro analýzu AAV a dalších makromolekul.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce citlivá a reproducibilní analýza agregátů proteinů i virových vektorů v kvalitativní i kvantitativní oblasti.
• Rychlá validace šarží a rutinní kontrola kvality v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace mobilních fází s nižší iontovou silou a rozšíření bioinertního povlaku pro kombinovanou detekci (MS, MALS).
• Automatizace a high-throughput platformy pro rutinní QC analýzu biologických léčiv.
• Aplikace na další biologické materiály, jako jsou nanočástice, liposomy či jiné virové vektory.

Závěr

Kombinace 3 µm monodisperzního média s bioinertním povlakem v kolónách SurePac Bio 550 SEC MDi poskytuje vynikající regeneraci vzorku, vysokou reprodukovatelnost mezi šaržemi i jednotlivými kolónami a spolehlivou separaci makromolekul pro biotechnologické a farmaceutické aplikace.

Reference

1. Ma K, Ashworth J, Nieves V, Koontz A, Bechler S. Size-exclusion chromatography of adeno-associated viruses with the SurePac Bio 550 SEC MDi column. Application Note 003089, Thermo Fisher Scientific, 2024.